新生血管生成促進合併缺氧的非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝纖維化形成的研究

文章來源：中華肝臟病雜誌, 2017,25(7) : 517-522

作者：劉江 吳巍 顧棟樺 劉春燕 董權 姚韻靚 王春生 陳曉平 楊紅霞

摘要

目的

優化製備合併缺氧的非酒精性脂肪性肝炎大鼠動物模型，探討其纖維化形成與新生血管生成的關係。

方法

將清潔級SD大鼠32隻隨機均分為正常對照組（A組）、缺氧對照組（B組）、高脂組（C組）、高脂缺氧組（D組），分別給予正常飲食、腹腔內注射亞硝酸鈉、高脂飲食、高脂飲食+腹腔內注射亞硝酸鈉，每組共飼養16周，B、D兩組在後8周每天腹腔內注射亞硝酸鈉模擬缺氧。檢測大鼠生物化學指標，進行肝組織非酒精性脂肪性肝炎活動度評分和纖維化評分、用Realtime PCR比較各組缺氧誘導因子1α、血管內皮生長因子1、血管內皮生長因子受體2、腫瘤壞死因子、白細胞介素1β、白細胞介素6。用免疫組織化學檢測血管內皮生長因子受體2、CD34表達，以染色陽性細胞數評分和染色程度評分之積為總評分來定量分析表達強度。計量資料採用t檢驗，等級資料採用秩和檢驗。

結果

C、D兩組的非酒精性脂肪性肝炎活動度評分> 4，D組HE染色可見到非酒精性脂肪性肝炎的病理學特徵，肝腺泡3區可見明顯脂肪變性，小泡性為主混合部分為大泡性脂肪滴，合併肝細胞氣球樣變性，小葉內炎症明顯。D組的Masson染色可見竇周纖維化合併門靜脈周圍纖維化，部分大鼠見到橋接纖維化。D組比C組的天冬氨酸氨基轉移酶、缺氧誘導因子1α、血管內皮生長因子1、血管內皮生長因子受體2明顯升高，差異均有統計學意義（P值均< 0.05），免疫組織化學檢測結果顯示血管內皮生長因子受體2、CD34表達總評分增加（P值均< 0.05）。

結論

高脂飲食基礎上給予腹腔內注射亞硝酸鈉能夠製備出合併缺氧的非酒精性脂肪性肝炎模型，模型的肝纖維化進展與缺氧誘導因子1α誘導新生血管的生成相關。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已成為國內人群嚴重的肝病之一，包括從單純性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH），到肝纖維化和肝硬化等一系列的病理學變化。NASH是NAFLD進展為肝硬化的限速步驟。NAFLD發生、發展的機制尚未明確，最具影響力的假說是"二次打擊"學說[1]。通過對阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）患者的研究，有學者發現慢性缺氧在NAFLD的發展中具有重要作用。慢性缺氧很有可能是NAFLD發病機制的"二次打擊因子"。然而，慢性缺氧導致NASH的確切機制沒有得到闡述。我們前期採用了高脂飲食8周誘導建立單純脂肪肝階段大鼠動物模型，繼以腹腔內注射亞硝酸鈉（NaNO2）40 mg·kg-1·d-1共4周模擬慢性缺氧條件，初步建立了合併缺氧的NASH大鼠模型，但是不夠穩定。本研究繼續調整高脂飲食時間及腹腔內注射NaNO2誘導劑量及時間，優化製備了穩定成熟的合併缺氧NASH大鼠模型，明確了慢性缺氧能夠加速NASH的進程並且促進了纖維化的形成，並探討了其中的炎症因子和新生血管的變化，現報道如下。

材料與方法

1.實驗動物與試劑：清潔級SD大鼠32隻，體質量150~180 g，雄性，購自上海傑思捷動物公司。高脂飲食配方為高脂飼料由80.5%基礎飼料，2%膽固醇，7%豬油，10%蛋黃粉及0.5%膽鹽，購自江蘇省協同醫藥生物公司。NaNO2購自上海生工生物公司。血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、甘油三酯（TG）試劑盒均購自南京生物建成有限公司。總RNA提取使用日本TaKaRa Bio生物公司RNAisoPlu；反轉錄使用日本TaKaRa Bio生物公司M-MLV（RNaseH) reverse transcriptase；熒光定量PCR試劑用日本TaKaRa Bio生物公司SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒；組織化學抗體CD34購自谷歌生物公司；VEGFR2購自美國Abcam公司。

2.動物分組：大鼠適應性飼養7 d後，隨機分為4組，每組8隻。A組為正常對照組，普通飼料16周。B組為缺氧對照組，普通飼料16周，後8周開始每天腹腔注射亞硝酸鹽20 mg/kg。C組為高脂組，高脂飼料16周。D組為高脂缺氧組，高脂飼料16周，後8周開始每天腹腔注射亞硝酸鹽20 mg/kg。在大鼠高脂飼料餵養8周，以肝組織學HE染色驗證大鼠確實處於單純脂肪肝階段（另外設組，實驗結果沒有納入本研究）。

3.生物化學指標檢測：抽取鼠血清，檢測ALT、AST、TG，按試劑盒說明書檢測。

4.肝組織NAFLD活動度積分（NAFLD activity score，NAS）和肝纖維化評分（FibroS）：取肝左葉，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色及Masson膠原纖維染色，光鏡下觀察。參照美國國立衛生研究院NASH臨床研究網病理工作組指南[2]，進行NAS和FibroS。由病理科兩位醫師盲法閱片評分，取平均值為最終評分。NAS評分> 4判斷為NASH，其中肝細胞脂肪變分4級，0分：< 5%；1分：> 5%~≤33%；2分：> 34%~≤66%；3分：> 66%。壞死灶數評價炎症程度：0分，無病灶；1分，少於2個病灶；2分，2個至4個病灶；3分，多於4個病灶。纖維化程度評分：無纖維化：0分；肝腺泡3區輕、中度竇周纖維化或僅門靜周圍纖維化：1分；腺泡3區竇周纖維化合併門靜脈周圍纖維化：2分；橋接纖維化：3分；肝硬化：4分。

5.實時熒光定量PCR檢測肝組織缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）、腫瘤壞死因子（TNF）α、白細胞介素（IL）1β、IL-6、血管內皮生長因1（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEFGR2）表達：TaKaRa RNAisoPlus提取總RNA後，取1 μg總RNA以M-MLV逆轉錄梅合成cDNA，SYBR Premix Ex TaqTM II擴增，在CFX Touch上進行real time PCR。β-肌動蛋白cDNA作為內參照。反應條件如下：95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。引物序列見表1。

6.免疫組織化學檢測VEGFR2、CD34的表達：石蠟切片脫蠟至水洗後，置於EDTA抗原修復緩衝液（pH8.0）進行抗原修復，3%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶，3% BSA封閉30 min，滴加BSA按一定比例配好的第一抗體，加與第一抗體相應種屬的第二抗體（HRP標記）覆蓋組織，室溫孵育50 min。DAB顯色，陽性為棕黃色，Harris蘇木素復染3 min，脫水封片。光學顯微鏡下觀察結果。（1）VEGFR2判定標準：VEGFR2陽性表達顆粒分布於細胞質和細胞膜，呈棕黃色。以染色陽性細胞數評分和染色程度評分之積為總評分，進行結果評定。陽性細胞數評分：未見陽性細胞為0，陽性細胞< 25%為1，≥25%~≤50%為2，> 50%為3。染色程度評分：未見染色為0，出現淡黃色顆粒為1，出現棕黃色顆粒為2。（2）最大密度的微血管密度（micro-vascular density，MVD）CD34判定標準：被抗體染色的單個內皮細胞或細胞團，無論是否形成官腔，只要與周圍界限清楚，都計數為1個微血管。匯管區、硬化區、交界區軟組織內微血管以及管徑> 8個紅細胞直徑的血管均排除在外。先於低倍視野(×40和×100)下確定4個血管著色最密集區域，然後在高倍視野(×400)內計數微血管的數目，取4個視野的均值作為MVD。

7.統計學方法：計量資料以均數±標準差（±s）表示，用SPSS12.0軟體進行統計分析，計量資料採用t檢驗，分級資料採用秩和檢驗，以中位數（M）四分間距（Q）表示。P< 0.05為差異有統計學意義。

結果

1．各組體質量變化及存活率

各組大鼠隨著餵養時間增加，體質量逐步增加，其中以高脂組增加最顯著，其次為高脂缺氧組，而缺氧對照組體質量增加較少。各組存活率均為100%，見表2。C、D兩組差異無統計學意義（P= 0.518）。

2．生物化學指標比較：

C、D兩組的ALT、AST、TG都有明顯升高，和A組比較有統計學差異（P< 0.05）。相對C組，D組AST明顯升高，差異有統計學意義（P< 0.05），而ALT、TG比較差異無統計學意義，說明在高脂基礎上加入缺氧後肝功能的損害明顯增加了。見表3。

3．肝組織學的NAS評分、纖維化評分：

各組大鼠在餵養16周後處死，進行病理學觀察。大體標本觀察發現，A組大鼠肝臟組織肉眼為鮮紅色，邊緣銳利，表面光滑。B組大鼠肝臟組織可見暗紅色，邊緣銳利，表面光滑。C、D組可見大鼠肝臟組織呈瀰漫性腫大，表面色澤蒼白或帶灰黃色有大量紅黃相間的細顆粒，邊緣鈍而厚，切面呈黃紅或淡黃色，有油膩感。

HE染色結果顯示，A組肝細胞正常，排列緊密。B組肝細胞排列紊亂，胞體增大，胞質呈透明狀，胞核仍位於細胞中央，呈水樣變性，無脂滴空泡。C組大鼠出現了NASH特徵，肝腺泡3區可見明顯脂肪變性，但主要以小泡性脂滴為主，部分為大泡性脂滴，合併肝細胞氣球樣變性，小葉內炎症明顯。D組大鼠也出現了NASH特徵，和C組類似，但是小葉內炎症反而較C組有所減輕。組織學評分比較發現A、C二組、C、D二組的NAS評分Z值分別為3.411、2.534，差異有統計學意義（P< 0.05）。D組即高脂缺氧組的NAS評分較C組即高脂組都是> 4，但是D組較C組低，是由於小葉內炎症的評分下降，Z= 2.692，P= 0.007，見表4。

Masson染色結果顯示，A、C二組、C、D二組的纖維化評分（FibroS）的Z值分別為1.852、3.115，A、C二組之間差異無統計學意義（P= 0.064），而C、D二組之間差異有統計學意義（P= 0.002），說明了高脂基礎上加入缺氧因素後，纖維化明顯加重，明確了慢性缺氧能夠加速纖維化的進程。見表4。

C、D二組的脂肪變性基本相似，但是小葉內炎症而言，C組較重，因此C組的NAS評分高於D組（圖1）。C組的纖維化少見，部分大鼠可見肝腺泡3區輕、中度竇周纖維化或僅門靜脈周圍纖維化，而D組加入缺氧因素後腺泡3區可見竇周纖維化合併門靜脈周圍纖維化，相當一部分大鼠見到橋接纖維化（圖2）。

圖1各組大鼠HE染色結果

圖2各組大鼠Masson染色結果

4．HIF1α、炎症因子、血管生成指標Realtime PCR：

缺氧能夠導致一系列的變化，本研究檢測了HIF1α、炎症因子TNFα、IL-6、IL-1β、血管生成指標VEGFA及其受體VEGFR2。C、D兩組之間的HIF1α、VEGFA、VEGFR2差異均有統計學意義（P< 0.05）。A、C兩組比較VEGFA差異有統計學意義（P= 0.027）。常見的炎症因子比較發現，C、D兩組之間的TNFα、IL-6、IL-1β差異無統計學意義，說明疊加了缺氧的D組的纖維化加重與炎症是沒有關係的。A、C組比較TNFα、IL-6、IL-1β，C組明顯升高，差異有統計學意義，（P< 0.05），說明炎症因子參與了C組的NASH的形成。見表5、圖3。

圖3各組缺氧誘導因子1α、炎症因子及血管生成指標mRNA相對表達量比較

5．血管生成指標免疫組織化學：

A、B二組不表達VEGFR2，C、D二組可見陽性表達，D組密度高和強度明顯，定量分析比較的P值為0.001。CD34是公認的新生血管生成的標誌物。CD34陽性定位於血管內皮細胞膜，呈棕黃色顆粒，可呈條索樣或者扁圓形，部分有管腔形成。D組即高脂缺氧組的CD34的微血管密度MVD比高脂組即C組明顯升高，定量分析比較的P< 0.05，說明和D組的纖維化和新生血管的生成密切相關。表6、圖4、圖5。

圖4各組免疫組織化學血管內皮生長因子R2比較

圖5各組免疫組織化學CD34比較

討論

慢性缺氧很有可能是非酒精性脂肪性肝病發病機制的"二次打擊因子"。我們回顧了本院呼吸科通過多導睡眠儀確診的146例中重度OSAS患者，發現合併NAFLD者高達69.2%，提示了慢性缺氧在NAFLD的發展中具有重要作用。對病態肥胖診斷有NAFLD伴隨慢性ALT升高者的研究發現，肝臟纖維化分期為F2~F4的患者OSAS發病率高，纖維化和平均夜間氧飽和度< 95%獨立相關[3]。對101位擬行肥胖手術治療的病態肥胖患者的調查發現了OSAS對肝臟損害的影響，該研究以氧飽和度指數（ODI）來評價OSAS的嚴重程度，肝活組織檢查來評價肝臟情況。結果顯示，校正其他危險因素（如胰島素抵抗）後，多因素分析提示ODI仍然與纖維化和NAFLD活動度評分（NAS）相關。這個研究最終為慢性缺氧參與NASH的發病機制提供了更多的證據，而且慢性缺氧這個因素是獨立於胰島素抵抗的[4]。然而，除了胰島素抵抗外，缺氧導致NASH的確切機制沒有得到闡述。因此，建立缺氧相關的NASH動物模型有助於揭示NASH的發病機制。

採用腹腔內注射NaNO2，NaNO2能誘導血液中正常攜氧的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，失去攜氧能力而引起組織缺氧。實驗中我們以這個注射NaNO2的方法能夠較好地模擬缺氧狀態。而且，從較長的觀察時間（如24 h）來看，其實就是一種反覆的慢性缺氧過程。這一點在我們前期的研究中通過測定大鼠股動脈氧分壓和高鐵血紅蛋白水平得到了驗證。

前期日本學者以膽鹼缺乏的高脂飲食餵養大鼠8周，在第5周開始也採用這個腹腔注射NaNO240 mg·kg-1·d-14周模擬慢性缺氧，誘導建立了符合NASH病理特徵的大鼠模型[5]。可是模型組大鼠體質量明顯減輕，血清和肝臟組織的TG水平反而明顯降低。這和臨床常見的OSAS患者合併NAFLD患者大多明顯超重的情況不吻合，因此這樣的模型的應用價值有限，有必要進一步優化。

我們前期建立的模型不夠穩定，肝臟纖維化情況也不明顯。因此，本研究逐步摸索和調整了高脂飲食的誘導時間（4、8、12、16周）、腹腔內注射NaNO2的劑量（10、20、30、40 mg·kg-1·d-1）和時間（4、6、8周）等多個參數，最終以高脂飲食誘導時間16周、腹腔內注射NaNO220 mg·kg-1·d-1持續8周，優化製備了穩定的合併缺氧的NASH大鼠動物模型，並重複了三次實驗，證明了模型的穩定性。

D組即加入了慢性缺氧因素後比C組的纖維化明顯加重，然而NAS評分反而是下降的，主要是因為小葉內炎症較C組減輕，而不是因為脂肪變性在減輕。而一些前期的研究發現高級別的NASH及其肝硬化的患者肝組織中的脂肪變性較輕，這一點和本研究是不一致的，有待於進一步研究探討。

參考文獻（略）

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