中國科學家重要突破：克隆猴「中中」「華華」來了！
中科院神經所率先克隆出兩隻猴：「中中」（左）和「華華」（右），圖片來自神經所
「這項成果將不僅為動物研究帶來革命性的變化，還會促進人類疾病治療新方案的開發。」
——《細胞》雜誌主編Emilie Marcus
撰文 | 葉水送、呂浩然
責編 | 陳曉雪
1997年，科學領域發生了一件大事，它既引起了科學家群體的廣泛關注，同時又成為街談巷議的話題，這就是克隆羊「多莉」的誕生。20多年過去了，科學家利用體細胞核移植技術（SCNT）克隆出了許多其他哺乳動物，如豬、牛、羊、貓、狗等。
事實上，這期間也有很多學者曾嘗試克隆與人類更加接近的非人靈長類動物。1999年，俄勒岡國立靈長類研究中心Gerald Schatten教授成功地用胚胎分裂的方式克隆出一隻恆河猴，但由於並未運用體細胞核移植技術，所以並未引起廣泛關注。除此之外，俄勒岡美國國家靈長類中心Shoukhrat Mitalipov教授、匹茲堡大學Calvin Simerly等人也嘗試用體細胞核移植技術克隆非人靈長類動物，均未成功。
近日，這一難題被來自中國科學院上海神經科學研究所的科學家攻克，他們率先利用體細胞核移植技術克隆出兩隻獼猴，完成這一實驗的是以中國科學院神經科學研究所研究員孫強及和博士後劉真為主的團隊。
體細胞核移植技術（SCNT）克隆出獼猴，圖片來自Cell
非人靈長類體細胞克隆歷史，圖片來源：孫強
1月25日，《細胞》（Cell）雜誌不同尋常地提前公布了這一重磅研究。
「這項成果將不僅為動物研究帶來革命性的變化，還會促進人類疾病治療新方案的開發。」《細胞》雜誌主編Emilie Marcus告訴《知識分子》。
值得注意的是，該論文從投稿到接收不到1個月時間，足以顯示《細胞》雜誌編輯對該研究的重視。Marcus表示，「《細胞》雜誌能有機會發表如此令人振奮的重要的研究成果，我們感到非常榮幸。我們一向致力於在保證每篇論文都經過嚴格、公正審核的前提下，向大眾儘快地傳播能拓展新領域、有顯著意義的科研成果，這次也不例外。這篇論文的審稿人對論文的反饋，都非常迅速和肯定，再加上作者配合等因素，促成了這篇文章能在《細胞》雜誌上快速發表。」
克隆猴的簡易流程圖，圖片來自Cell
這兩隻克隆猴擁有一個意味深長的名字：「中中」和「華華」，象徵著「中華」。目前，兩隻克隆猴出生時間分別為8周和6周，同普通的猴子一樣，能正常地生長。
「中中」和「華華」是如何誕生的？
在成功克隆猴之前，研究人員嘗試了不同的方法，均告失敗。「但只有一種方法最終奏效」，孫強表示。同時他也指出，在克隆猴子的過程中，有四個關鍵性的節點：胚胎構建、卵細胞激活、核基因啟動、著床後發育。如何攻克這四個節點對於研究人員來說也是極大地挑戰。
研究顯示，已分化的猴細胞核對體細胞核移植技術有抗性，因此孫強與同事在細胞核轉移後，引入表觀遺傳調節劑，打開或關閉抑制胚胎髮育的基因。他們發現，當向融合細胞中注入去甲基化酶Kdm4d的mRNA，去除組蛋白甲基化修飾，並用組蛋白去乙醯化抑製劑TSA處理細胞時，能極大地改進滋養體發育和在代孕母猴中成功懷孕的比例。
兩組實驗中克隆猴囊胚的發育比較，圖片來自Cell
在這項研究中，研究人員設計了兩組實驗：一組是利用胎兒纖維組織母細胞，作為融合細胞的細胞核來源，這些細胞來自流產幼猴的組織；另一組實驗，利用成年猴子的卵丘細胞作為融合細胞的細胞核來源。
兩組實驗懷孕及胎兒成功發育的比例，圖片來自Cell
兩組實驗取得了不同的結果：在第一組實驗中，21隻代孕母猴中的6隻成功懷孕，最終生下了2隻健康的猴子，它們就是「中中」和「華華」；另一組研究，42隻代孕母猴中有22隻成功懷孕，最後也有兩隻猴子出生，可惜的是，它們短暫存活後死亡。
「Tetra」猴的克隆技術簡圖，圖片來自crystalinks.com
早在1999年，就有科學家克隆出了靈長類動物，這是一隻名為「Tetra」的克隆猴，只不過它的誕生是通過胚胎分裂的方法，即胚胎髮育到8細胞時，人為地被分為2個4細胞的胚胎，再分別發育，該方法並非使用常規的動物克隆技術體細胞核移植進行，因此無論從科學意義還是實用性上，都比較受限。
但是，此次神經所的工作系通過體細胞核移植技術克隆猴子，難度更大。為建立體細胞核移植技術的流程，快速以及精準地從卵細胞中取出細胞核，並促使體細胞與去核的卵母細胞融合，論文的第一作者劉真博士花了3年時間練習以及優化該流程。最終在表觀因子的刺激下，重新激活被抑制的基因，大大提高了胚胎髮育的效率和代孕母猴成功懷孕的比例。
「體細胞核移植技術流程非常關鍵，操作越快，卵細胞受損就會越小，劉博士在這方面做的很出色。」中科院神經研究所所長、論文的合作者蒲慕明表示，「劉真可能在10秒之內對卵母細胞進行細胞去核操作，在15秒之內將體細胞注入到卵母細胞當中。這需要很長的練習，並非每個人都能精準且快速地操作去核、細胞融合，流程的優化極大地幫助了我們。」
靈長類動物的克隆難度為何這麼大
截至目前，已經有23種哺乳動物通過體細胞核移植的方法被成功克隆，它們有的作為動物模型用在科研中，有的則作為人類潛在的器官供體來源（例如克隆豬）。越接近於人類，動物模型應用的價值越大，與此同時克隆的難度也越大。
為何靈長類動物的克隆會更難？江蘇省異種移植重點實驗室主任、「千人計劃」學者戴一凡表示，「不同物種之間卵子成熟、胚胎髮育條件都不一樣，靈長類取卵的成本很高，不能做很多試驗摸條件。」他同時表示，「只要測試很多不同的條件或找到最佳條件，克隆猴的出現也是遲早的事。」戴一凡正在研究克隆豬作為異體器官供體來源，他此前在PPL治療公司（PPLTherapeutics）工作，該公司擁有非常輝煌的過往，曾資助多莉羊的克隆實驗，並與英國愛丁堡Roslin研究所共同克隆出多莉羊。
考慮到第一頭克隆羊「多莉」的壽命僅有7年，一個顯而易見的問題是：利用體細胞核移植技術克隆的動物，壽命是否會減少？對此戴一凡表示：「克隆對動物的壽命應該沒有影響，多莉羊是因為感染了病毒而安樂死的，不是因為衰老而死。」
「中中」和「華華」的問世有哪些意義
談到此次「中中」「華華」問世的意義，蒲慕明表示：「體細胞克隆猴的成功將推動中國率先發展出基於非人靈長類疾病動物模型的全新醫藥研發產業鏈，促進針對阿爾茨海默病、自閉症等腦疾病，以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新葯研發進程，同時也讓中國成為世界腦科學人才的匯聚高地。」
理想的動物模型是人類探究疾病、進行基礎醫學試驗的重要工具。一直以來，科學家孜孜不倦地追求理想的動物模型，尤其是對靈長類動物模型的構建。
「有關靈長類的很多研究問題，都可以通過這一技術構建的靈長類動物模型得到解答。」孫強表示，「通過克隆技術，我們可以生產出遺傳背景一致的猴子，可以用在大腦疾病、癌症、免疫甚至代謝類疾病研究方面，亦可以幫助我們在藥物臨床前試驗中，檢測其有效性。」
同濟大學醫學院教授、「千人計劃」學者孫毅亦表示，「長遠來看，靈長類動物做疾病模型優勢巨大，目前很多疾病的分析方法還沒有完全在靈長類模型上成熟應用，不過這也是時間和經費的問題。研究靈長類和研究人類有很多相似性，由於能收割猴的組織直接分析，從而會協助和建立無創或微創方法用於臨床，意義重大。」2017年，孫毅同昆明理工大學季維智院士、陳永昌教授合作，在《細胞》雜誌發表利用TALEN技術，構建瑞特綜合征（Rett syndrome，RTT）的食蟹猴模型。
目前，靈長類動物模型的構建的有哪些？克隆的方式有優勢嗎？「靈長類動物模型有多種，對於遺傳性疾病，就需要進行基因編輯。目前，有通過病毒載體的方法用於受精卵或直接在體特異性地干預，也有通過對受精卵做TALEN 、CRISPR/Cas9的基因編輯。」孫毅介紹說。她指出，「如果克隆猴的表觀遺傳特徵和正常體外受精（IVF）的胚胎及出生後個體很相似，那麼先在體細胞里做全方位的基因編輯和精細檢測，然後通過核移植進一步得到所需的疾病模型，會很有優勢。前提是克隆的表觀遺傳特徵是正常的，否則就繞更大的彎路了。對克隆來說，最大的擔心就是表觀遺傳的不正常。」
值得一提的是，此次實驗嚴格地遵循美國國立衛生研究院（NIH）國際動物研究指導條例。但孫強和蒲慕明仍鼓勵科學群體對動物研究的倫理問題進行深入討論：非人靈長類動物克隆研究可接受的操作是什麼、不可接受的操作是什麼。「我們清晰地意識到，未來非人靈長類動物的研究，科學家應需嚴格地遵循當地的倫理準則。」蒲慕明表示。
參考文獻：
· Zhen Liu, Yijun Cai, Yan Wang, Yanhong Nie, Chenchen Zhang, Yuting Xu,Xiaotong Zhang, Yong Lu, Zhanyang Wang, Muming Poo, and Qiang Sun. Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer. Cell, 2018. 172, 1–7. DOI:10.1016/j.cell.2018.01.020.
· Meet Zhong Zhong and Hua Hua, the first monkeyclones produced by method that made Dolly.
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