世界首例體細胞克隆猴成功誕生 背後那些艱辛事你知道嗎？
出品 | 新浪科技《科學大家》
撰文 | 孫強 中科院神經科學研究所非人靈長類研究平台主任
世界首例體細胞克隆猴「中中」「華華」上海誕生
編輯註：提起現代生物技術，令人印象最深的恐怕就是克隆技術， 1997年 「多莉羊」的誕生，讓克隆這個詞一下子家喻戶曉。隨之而來，馬、牛、羊等大型家畜成功克隆，多種實驗動物如小鼠、大鼠、兔也都順利克隆，但與人類最相近的非人靈長類動物體細胞克隆的難題卻一直沒有得到解決，成為世界性難題，沒有克隆猴，就很難建立模擬人類疾病的動物模型，而如今，這個難題被中國科學院腦科學與智能技術卓越中心研究團隊攻克，在國際上首次實現了非人靈長類動物的體細胞克隆！2017年11月27日世界上首個體細胞克隆猴「中中」誕生； 12月5日第二個克隆猴「華華」誕生，孫悟空一把毫毛變出一群猴子的神話成真！談到體細胞克隆猴背後的艱辛歷程，讓中科院神經科學研究所非人靈長類研究平台主任--孫強在彙報中一度哽咽落淚。
首先我想讓大家看下SHOUKHRAT M。 MITALIPOV的實驗室在2010年發表的這篇論文，這是當時做克隆最好的實驗室，蒲慕明院士（中科院院士、中科院神經科學研究所所長、中科院腦智卓越中心主任）2012年在浙江烏鎮舉行的非人靈長類研究小型專題研討會上提出，要開展猴體細胞克隆的工作，中國也要趕上摘下體細胞克隆桂冠，隨後這項艱巨的任務就交給了我。我當時感到有些驚訝，因為我們的實驗室從2009年開始搭建，雖然在2011年時得到自閉症研究的投資，但是在克隆領域，尤其是體細胞領域及猴子領域沒有涉入過，所以這項任務對當時的我們來說是很重的。
哺乳動物的體細胞克隆技術
這項任務該如何完成？首先科普一下哺乳動物體細胞克隆技術。
體細胞克隆就是將體細胞培養後，注入去除遺傳物質的卵子內，通過人工方式激活後再送入受體，最終發育成個體的一個過程。體細胞克隆猴，就是利用猴子的體細胞，複製出相同的個體。
體細胞對應的是胚胎細胞，胚胎細胞具有發育全能性且數量有限，發育全能性通俗來講，就是我們每個人都是由一個受精卵開始，然後發育成人。早期的胚胎細胞可以通過分裂胚胎的方法分出雙胎，但這並不是實際意義上的克隆。體細胞沒有細胞全能性，是執行特殊功能的，比如紅細胞是執行運氧功能的，免疫細胞是執行免疫防禦功能的，它們不具有發育的特性，但部分體細胞可以在體外培養可以實現無限增殖，因此，我們可以培養出無數個體細胞用以克隆。
體細胞克隆的過程首先需要取得體細胞，我們可以在體外培養過程中進行基因編輯等操作。體細胞需要藉助於卵母細胞的胞質才能具有全能性。我們將卵母細胞去核（這在技術上和操作上是最難的），然後把體細胞和去核的卵母細胞融合併激活，重新構建成一個克隆胚胎，將克隆胚胎移植進受體動物，讓它像早期正常的受精卵一樣去發育，然後經過卵裂、著床，最後變成克隆後代個體。
哺乳動物體細胞克隆研究概況
克隆流程說起來簡單但做起來卻很難。1997年誕生了多莉羊，小鼠、豬隨後都克隆成功， 2005年克隆狗成功誕生，而非人靈長類體細胞克隆的研究從2002年開始，有文獻報道的實驗室很多，美國、德國、日本也包括中國的實驗室也都投入研究，但直至2017年尚未有非人靈長類體細胞克隆動物出生的報道，問題出在哪裡？
一是猴子的繁殖能力低，傳代時間長。猴子的懷孕周期是160天，從小猴子出生到性成熟可以懷孕生育需要4-6年的時間。二是遺傳背景複雜，猴子的父親母親都不一樣，其基因來源不一樣，遺傳背景就不一樣，這樣導致個體差異大，對實驗干擾就會很嚴重。基於此，一直以來全世界各國的科研人員都在想各種辦法來努力攻克這個難題。
體細胞克隆的關鍵節點
介紹下體細胞克隆技術的幾個關鍵節點。百萬精子中一枚精子最後進入卵子形成受精卵，同時把卵子激活，這個激活過程很重要，所以在發育生物學上有一個很經典的比喻，叫精子的親吻喚醒了沉睡的美人。
體細胞克隆這個過程胚胎沒有自然受精，需要通過顯微操作技術，去除細胞核再注射融合到一起，胚胎在發育到囊胚期開始著床，著床後便無法進行人工干預，所以關鍵步驟就是如何去激活。靈長類包括人在內在四細胞階段只要有激活信號，細胞就會卵裂，但是在四細胞之後，只有啟動正常的核基因組，才能完成後續的發育，也就是說胚胎細胞從一個細胞依次分裂為2、4、8個細胞對的過程最為關鍵。核基因組啟動前，體細胞核要經歷一個回復到早起胚胎核狀態的過程，稱之為基因重編程，如果能把這個過程式控制制好，就能提高體細胞胚胎的發育率。
體細胞增殖總結下來有四個節點，第一是有一個體細胞組成的胚胎，第二是能夠把胚胎激活，第三要能夠啟動核基因組，最後一個節點是把胚胎放在子宮和輸卵管里，讓它們著床發育成個體。除了最後一個節點無法控制，我們從前三個節點想辦法干預。
猴核移植技術難度高
卵母細胞的去核操作我們先從小鼠實驗開始，把小鼠的卵母細胞固定住，用很細的針把核去除掉，這項工作比較容易操作。但是換成猴子的卵母細胞就並非易事了，由於猴子細胞不透明，在顯微鏡下看不到細胞核，需要通過偏振光才能把細胞核顯示出來，經過長時間的訓練，團隊成員劉真博士已經做到10秒內取出一個猴子卵母細胞核，整個過程需要極其快速精確，因為這個過程對卵母細胞損傷很大，如果細胞有損傷，後續的工作便無法進行。
除了去核要求速度快外，注入細胞同樣要求非常快，我們的團隊成員可以做到15秒內實現體細胞注入操作，只有精湛的技術才可以保證對卵母細胞損傷最小，另外體外時間越短損傷也越小。
體細胞克隆過程中另一個難點是克隆體的囊胚發育狀態比較差，對比小鼠和豬，猴的囊胚發育率比較低。優質胚胎才能發育成個體，只有內細胞團發育好才能成為優質胚胎。有時我們會遇到在克隆胚胎中看不到內細胞團，那麼這個問題該怎麼解決？
從重構胚胎到克隆胚胎，第一步是要激活，這就涉及到激活條件及培養條件。我們選用了離子黴素+6-DMAP的激活條件，發現克隆體囊胚率是13%，但是優質的囊胚一個都沒有，優質率為0。
後來我們發現在小鼠上有一種組蛋白乙醯化酶抑製劑TSA，可以調控組蛋白的表觀遺傳狀態。組蛋白乙醯化酶抑製劑處理後，囊胚率提高到16%，而且優質胚胎也增加了，但是還不太理想。2014年一篇文章報道用H3K9me3去甲基化酶Kdm4處理後，對小狗有很好的效果，我們嘗試採用後發現效果很好，囊胚率升到45%，優質胚胎率升高到29%。
工作到了這裡有了明顯的進展，也就是從這個時候，為了保持實驗的連貫性，團隊的成員取消了休假，甚至過年也沒有真正的休息過。
體細胞克隆猴的誕生
猴子實驗比較特殊，要根據月經周期，需要在月經期前3天開始打針持續十幾天。我們用了127枚卵母細胞，做了109個重構胚胎，對21隻猴子受體進行移植，獲得了6隻懷孕受體，最後只有兩隻個體順利出生。但用供體6隻的數量與2隻存活個體數量比較，我們的技術成功率大約為30%，靈長類的繁殖的成功率為5%左右，從這個角度看，我們實現了突破。
視頻中可以看到兩隻雌性克隆猴「中中」和「華華」，它們喝奶粉、墊尿不濕、24小時監控，在專業醫護人員的看護下，這兩隻世界首例通過體細胞克隆的小猴正在健康成長。
最後，兩隻克隆猴「中中」和「華華」通過DNA親子鑒定，通過27個微衛星位點分析證明核基因組信息與供體體細胞完全一致。
體細胞克隆猴技術獲得突破後，下一步的首要工作就是要通過提升克隆猴的成功率，構建出一大批具有完全相同遺傳基因的猴群。這是製作腦科學研究和人類疾病動物模型的關鍵技術。體細胞克隆猴的成功誕生，突破了生命科學研究和人類疾病研究中急需的非人靈長類動物模型製作的關鍵技術，實現了在較短時間內（一年）大量生產遺傳背景高度一致的非人靈長類實驗動物和疾病動物模型，必將極大促進生命科學基礎研究和轉化醫學發展研究。
致謝
體細胞克隆猴的成功是與整個團隊的辛勤付出分不開的，還要感謝我們專業的獸醫團隊，由於擔心猴子會流產，獸醫團隊做了很多模型猴並建立了值班制度。每當有要臨產的猴子，提前一個月就放置在有監控的實驗室，如果猴子有臨產的跡象，就會馬上通知獸醫，我們的獸醫非常辛苦，經常會被夜晚叫醒。
最後我要感謝，首先是感謝蒲慕明老師，一直支持我們。還有團隊中的所有成員，包括我們的獸醫團隊等等，謝謝他們辛勞的付出。
文章根據中科院神經科學研究所非人靈長類研究平台主任孫強在世界首個體細胞克隆猴成果新聞發布會上的報告整理而成。
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