細胞自噬在角膜疾病的研究進展
綜 述
Review
文章來源：朱奕睿,朱韓磊,陳蔚.細胞自噬在角膜疾病的研究進展[J].中華眼視光學與視覺科學雜誌,2017,19(12):765-768.
摘 要
自噬是一種廣泛存在於細胞內依賴於溶酶體的降解蛋白質的過程，通過清除細胞內一些受損的異常蛋白質和細胞器以維持細胞穩態。隨著自噬在免疫防禦、腫瘤、神經退行性變等方面越來越多地受到關注，自噬與眼病的關係也逐漸成為眼科基礎研究的焦點。本文對自噬在角膜疾病方面的研究進展做一綜述，以期為角膜疾病的治療提供新的思路和方法。
關鍵詞
自噬；角膜；綜述
全 文
細胞自噬是細胞將自身一些蛋白質和細胞器包裹在特定的膜結構中，送入溶酶體降解，產生能量和小分子的過程。這對細胞耐受飢餓，清除細胞內錯誤摺疊的蛋白質和受損衰老的細胞器，維持內部穩態至關重要。自噬通常分為3種：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬[1]。研究表明，細胞自噬在維持細胞內穩態、免疫防禦、癌症、心力衰竭、神經退行性疾病、傳染病、衰老相關性疾病等生命過程中發揮著重要作用[2-5]。此外，自噬還參與調節機體炎症反應，與炎症性腸病、肺結核、膿毒症等炎症性疾病的發病和治療相關[6-9]。眼部是由多種不同類型的細胞組成，有較多研究表明自噬參與角膜、小梁網、視網膜色素上皮細胞、視網膜和晶狀體的穩態平衡。不完全自噬會導致眼部病理改變，包括視網膜變性、視網膜損傷等[10-16]。近年來, 隨著自噬基因及其功能相繼被發現，自噬成為繼凋亡之後生命科學最熱的研究焦點之一。自噬與眼部疾病的關係緊密交織，隨著自噬研究的深入，已有很多學者在細胞和動物模型實驗中取得積極進展。
角膜相關的炎症、感染和免疫性疾病在臨床十分常見，且治療較為困難，嚴重者可完全喪失視力，嚴重影響患者的生活質量。自噬在角膜領域的研究近幾年剛剛興起，筆者對近年來角膜疾病自噬的研究進展進行總結，以期有助於細胞自噬在角膜疾病調控的深入研究，並為治療相關疾病提供理論基礎。
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2型顆粒狀角膜營養不良
2 型顆粒狀角膜營養不良主要表現為角膜淺基質層偏中心，散在的白色麵包屑樣混濁。在顆粒狀角膜營養不良中屬預後較好的類型，一旦影響視力，需要行激光手術進行治療。2 型顆粒狀角膜營養不良的發病機制是由於轉化生長因子β誘導的基因蛋白(Transforming growth factor-β-induced，TGFβI)某個基因位點（R124H）5q31號染色體基因發生突變，導致角膜上皮和基質蛋白逐漸累積，從而影響角膜透明度[17]。TGFβI蛋白是細胞外基質的重要組成部分，通過整合蛋白介導細胞的粘附和遷移。Choi等[18]發現在2 型顆粒狀角膜營養不良中易於突變的TGFβI蛋白容易廣泛聚集，被富含有微管相關蛋白1 輕鏈3（Autophagy marker light chain 3，LC3）的囊泡包裹並自噬清除，但TGFβI蛋白突變和自噬溶酶體之間潛在的作用關係仍不清楚。2 型顆粒狀角膜營養不良角膜纖維細胞中LC3Ⅱ增多，添加能抑制自噬溶酶體融合的H+-ATP酶抑製劑，結果發現角膜纖維細胞中LC3 Ⅱ的水平沒有發生變化。蛋白酶抑製劑MG132聯合泛素蛋白免疫印跡分析表明TGFβI蛋白的清除與泛素蛋白-溶酶體依賴通路無關，以上結果均表明自噬是以細胞內自我吞噬為主的。基於此理論，研究進一步採用雷帕黴素抑制自噬負向調節因子雷帕黴素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)來增強自噬作用，結果降低了TGFβI蛋白突變的水平，說明自噬不足可能是導致2型顆粒狀角膜營養不良的原因之一[18]。
雷帕黴素、金屬鋰這些毒性物質作為自噬的底物能增強自噬，常被用於治療退行性神經疾病。金屬鋰通過非依賴mTOR通路誘導自噬，抑制肌醇單磷酸酶，降低下游的三磷酸肌醇水平[19]。金屬鋰能使TGFβI蛋白低表達同時上調角膜纖維細胞中LC3Ⅱ：Ⅰ的比率，因此通過調節鋰介導的自噬可能可以治療2型顆粒狀角膜營養不良[17]。Choi等[20]研究還發現褪黑素介導的mTOR依賴性自噬可使自噬基因beclin-1 水平升高，褪黑素能激活2 型顆粒狀角膜營養不良的角膜纖維細胞產生自噬，纖維細胞連同雷帕黴素、褪黑素均能清除細胞內變異的TGFβI蛋白。這為2型顆粒狀角膜營養不良的藥物治療提供了指導方向。
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Fuch角膜內皮營養不良
角膜內皮營養不良是以角膜內皮細胞進行性變性萎縮的一類疾病，具有遺傳易感性[21]。Fuch角膜內皮營養不良是一類角膜內皮細胞密度逐漸下降，伴內皮沉積物、後彈力層增厚的疾病。Fuch角膜內皮營養不良可能與自噬過程改變密切相關。Matthaei等[22]發現 Col8a2 Q455K基因敲入的小鼠眼部表現為Fuch角膜內皮營養不良，建立了Fuch角膜內皮營養不良小鼠疾病研究模型。研究分別從形態學和分子機制方面揭示了損傷調節自噬因子Dram 1，即一種p53靶基因編碼溶酶體蛋白，誘導了巨自噬的產生。與同齡對照組相比，基因突變小鼠角膜內皮LC3明顯增高且伴隨自噬相關蛋白Atg12-Atg5 的下降，透射電鏡下可觀察到大量的空泡伴有部分細胞器的退行性改變[22]。患有Fuch角膜內皮營養不良的患者，其Dram 1基因表達比正常人高出10.4倍，動物模型的研究也有力地支持了這一觀點[23]。今後的工作還需對Fuch角膜內皮營養不良患者內皮細胞上缺損的自噬體超微結構進行分析和評估，對Col8a2 Q455K基因小鼠自噬溶酶體吞噬和蛋白降解的機制和原理等做進一步研究。
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單純皰疹病毒角膜炎
自噬在降解侵入性微生物的過程中起重要作用[24，25]。人角膜是1 型單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV-1）的原發宿主，HSV-1通過胞飲作用進入角膜內皮細胞[26]，使角膜感染單純皰疹病毒性角膜炎（Herpes simplex keratitis，HSK）從而影響視力。由於HSV-1 在三叉神經節及角膜內終生潛伏，HSK複發率高，嚴重的HSK治療效果往往不佳。關於HSV-1 在角膜潛伏和感染的機制尚不完全清楚，近年來有一些關於自噬與HSV-1 的最新研究。Leib等[27]採用小鼠HSV-1 角膜感染模型闡述了HSV的基因產物ICP34.5 通過與自噬基因beclin-1 相互作用抑制正常的自噬過程。研究者還發現HSV-1有2個重組體，68H和68HR。在感染早期，兩者複製速率相似，感染後68H被快速清除以減少角膜損害，這可能與自噬介導的微生物降解有關。有研究發現注射了68H的小鼠在感染HSV-1後4～6 d眼和大腦內LC3向LC3Ⅱ轉化增多，認為是自噬過程增強的標誌。2 組小鼠同側眼視網膜分別注射了68H和68HR，68H組感染較輕。68H還能誘導NOD-like receptor protein 3（NLRP3）炎症小體激活，增強固有免疫反應[28]。上述這些研究說明自噬是通過快速誘導固有免疫反應從而控制HSV-1 感染的，而炎症小體激活與自噬相互作用關係仍待進一步研究。
HSV-1 感染引發HSK的炎症機制目前尚不完全明確。Jiang等[29]研究證實感染HSK後 CD4+ T細胞激活，其中樹突狀細胞參與的自噬是調節主要組織相容性複合體Ⅱ依賴性抗原提呈和CD4+ T細胞激活的重要通路。在樹突狀細胞自噬不全小鼠模型上發現，樹突狀細胞自噬與HSK早期免疫細胞浸潤、病毒清除、宿主細胞存活息息相關。Yakoub等[30]也證明自噬是抗HSV-1 感染的重要途徑，同時發現在一種細胞中自噬受到輕度抑制時，在另一種細胞中自噬仍可保持其基本水平，不受感染水平影響。這說明HSV-1 介導的自噬可能與固有免疫調節相關。
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乾眼
Karnati等[31]解碼了460 個已知的正常人眼的基因，其中包括15 個乾眼疾病相關基因。乾眼導致眼表炎症因子緩慢增加，淚液含量和滲透壓發生改變。乾眼環境下眼表谷氨醯轉移酶含量增高，芳基硫酸酯酶A、B，黏脂蛋白等突變均是眼部自噬不完全的原因。外源性淚液蛋白lacritin能增加淚液流動，維持眼表穩態，lacritin能刺激自噬增強，可能與人角膜上皮細胞穩定轉導自噬標記物LC3、EGFP和mCherry有關[32]。對pH敏感自噬標記物EGFP和對pH不敏感自噬標記物mCherry均能將自噬泡中與自噬溶酶體和隔離膜中的LC3區別開來[33]。隔離膜和自噬溶酶體分別攝取吞噬細胞中損壞的蛋白和細胞器。Lacritin開始介入作用10 分鐘內，mCherry信號佔主導地位，然後部分轉化為EGFP，EGFP信號在阻斷自噬溶酶體融合後逐漸增強，說明lacritin能增強自噬[32]。目前觀察到lacritin只能在選擇性轉移蛋白突變體Htt103Q中增強自噬，應激是自噬增強的前提。Wang等[32]發現體外培養的角膜上皮細胞的穩態是lacritin依賴性的，闡明了快速自噬可促進細胞新陳代謝和線粒體融合。保持應激狀態是lacritin刺激性自噬維持的先決條件。lacritin主要作用於細胞表面的蛋白多糖-1，可能對維持上皮細胞穩定有促進作用。
乾眼是眼表的慢性炎症，與自噬存在緊密的關係，但目前關於乾眼的自噬研究非常薄弱。自噬能抑制炎性因子激活反應[34]，通過持續清除內源性刺激物來降低炎症反應。自噬通過清除內源性來源的炎症體激活劑（活性氧和失活線粒體）來抑制細胞炎性物質的活化。在基礎自噬缺失的情況下，內源性因子激活炎症反應，增強白細胞介素IL-1β的作用。乾眼的炎症機制已有較多研究[35，36]，自噬機制的發現豐富了乾眼機制的研究，並為乾眼的治療提供了新的思路和方法。但是目前關於自噬在乾眼中作用尚不明確，還需在動物模型和分子水平做深入研究。
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自噬抑製劑的應用
細胞自噬與飢餓、分化、發育和免疫各方面緊密相關，通過抑制自噬抗腫瘤治療的基礎研究已有報道[37]。自噬抑製劑有3-甲基腺嘌呤，LY294002，渥曼青黴素，巴佛羅黴素A和氯喹。3-甲基腺嘌呤能減少鈣蛋白酶的激活，減少病毒複製，從而引起結腸腫瘤細胞的凋亡[38，39]。抑制自噬治療眼部疾病的研究較少。近來有研究者將自噬抑製劑用於棘阿米巴角膜炎的治療[40]。在棘阿米巴原蟲細胞中，Atg8，Atg3，Atg16L等自噬基因與包囊形成相關[41-43]。Moon等[40]研究發現低濃度（0.00125%）聚六亞甲基雙胍聯合3-甲基腺嘌呤、渥曼青黴素、氯喹其中任一種自噬抑製劑能有效殺傷棘阿米巴原蟲細胞，且對角膜上皮細胞較安全。此研究為自噬抑製劑在眼部疾病的治療開創了新的思路，未來在與自噬相關角膜疾病的治療可進行深入研究。
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總 結
自噬在機體免疫、感染、炎症中作用的研究逐年增多，雖然自噬在角膜疾病中的研究仍處於起步階段，但在分子和動物水平已有部分發病機制相關的研究發現。本文主要總結了自噬與自噬相關角膜疾病之間的關係，現有研究表明自噬在感染炎症及免疫性疾病中發揮著重要的作用，進一步深入研究其機制及其與疾病的關係將為臨床應用提供新的思路。
DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2017.12.013
作者單位：325027 溫州醫科大學附屬眼視光醫院
