現代分子生物技術
現代分子生物技術及其在環境監測中的應用
摘要：現代分子生物學技術具有快速、便利、特異性高等優點，在環境檢測領域應用潛力極其廣闊。本文從聚合酶鏈式反應技術（PCR）、基因差異顯示法、生物感測器、核酸基因分子探針、生物晶元技術、酶聯免疫吸附技術（ELISA）、生物標記物法等7種現代分子生物技術的基本原理及其在環境監測中的應用進行簡要介紹。
關鍵詞：現代分子生物技術、環境監測、應用
環境污染問題已然嚴重影響人類的日常生活，並阻滯經濟的可持續發展，在如此嚴峻的當代環境形勢下，如何在保證經濟高速發展的同時有效治理環境，保證生態文明已然成為構建社會主義和諧社會急需解決的問題。而現代分子生物學技術具有快速、便利、特異性高等優點，在環境檢測領域應用潛力極其廣闊。
一、現代分子生物技術概論
現代分子生物技術，是指以現代生命科學為基礎，結合基因工程、酶工程、蛋白質工程、細胞工程以及現代微生物發酵工程等先進的工程、手段和其他基礎學科的科學原理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的。它是在分子生物學基礎上建立的創建新的生物類型或新生物機能的實用技術，是現代生物科學和工程技術相結合的產物。
（一）基因工程
基因工程，又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將外源基因通過體外重組後導入受體細胞內，使這個基因能在受體細胞內複製、轉錄、翻譯表達，從而以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。
（二）細胞工程
細胞工程，是指應用細胞生物學和分子生物學的理論和方法，按照人們的設計藍圖，進行在細胞水平上的遺傳操作及進行大規模的細胞和組織培養。當前細胞工程所涉及的主要技術領域有細胞培養、細胞融合、細胞拆合、染色體操作及基因轉移等方面。通過細胞工程可以生產有用的生物產品或培養有價值的植株，並可以產生新的物種或品系。
（三）現代酶工程
現代酶工程，是利用酶的催化作用進行物質轉化從而合成有用物、分解有害物的技術，是將酶理論與化工技術結合而形成的新技術。
（四）蛋白質工程
蛋白質工程就是通過對蛋白質化學、蛋白質晶體學和蛋白質動力學的研究，獲得有關蛋白質理化特性和分子特性的信息，在此基礎上對編碼蛋白質的基因進行有目的的設計和改造，通過基因工程技術獲得可以表達蛋白質的轉基因生物系統，這個生物系統可以是轉基因微生物、轉基因植物、轉基因動物，甚至可以是細胞系統。
綜述：
在不斷發展過程中，現代分子生物技術逐漸開始向環境科學與工程領域滲透。現代分子生物技術不僅作為一有效的技術手段將為環境工程提供了有效的污染治理、污染物監測等技術，也為深入、準確地理解環境微生物的特徵提供了實驗方法和科學依據。人類的生存與發展面臨著空前嚴峻的挑戰，現代分子生物技術擔負著重大的使命，並作為一種行之有效、安全可靠的手段和方法，起著核心作用。
二、現代分子生物技術在環境監測中的應用
（一）現代分子生物技術與生物監測
1.環境監測：運用物理、化學和生物等一切可以表徵環境質量的技術手段，對影響環境質量的代表值進行定性、定量和綜合分析，以確定環境質量及其變化趨勢。
2.生物監測：
生物監測，是指通過生物（動物、植物及微生物）在環境中的分布、生長、發育狀況及生理化指標和生態系統的變化情況，研究環境污染情況，測定污染物毒性的一類監測方法，具有長期性、連續性、富集性、綜合性、真實地反應環境質量狀況、連續監測、多功能性、監測靈敏度高、簡單易行等特點，有監視性監測、研究性監測、特種目的監測三種類型。
3.現代分子生物技術與生物監測：
現代分子生物技術靈敏度高、監測所需樣品量少等特點實現了生物監測技術逐步達到對分子、基因的監測水平，並通過對所選體系特定基因片段、DNA分子、生物活性指示指標的考察，得出外界干擾下環境生物的變化情況，進而推斷出環境受影響的程度和水平。
（二）PCR技術及其在環境監測中的應用
1.PCR技術概念：PCR技術，是一種利用DNA變性與復性原理在體外進行特定基因或DNA序列的快速擴增的方法。
2.PCR技術原理：
包括高溫變性、低溫退火、適溫延伸3個步驟。
高溫下（94-97℃），待擴增的靶DNA雙鏈受熱變化成為單鏈DNA模板，隨後降低溫度，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合（退火，55-72℃），形成部分雙鏈，再升溫至TaqDNA聚合酶的最適溫度（72℃）時，以引物3』-OH末端的新鏈生長點，以四種dNTPs為原料，沿模板5′3′方向延伸，合成新鏈DNA。這樣每一條雙鏈DNA模板，經過一次變性、退火、延伸三個步驟的熱循環後就成了兩條雙鏈DNA分子，如此反覆多次。
3.PCR技術特點：
（1）特異性強
（2）靈敏度高：PCR產物是以指數方式增加的，經過25-35輪循環後，可將微℃（3）簡便快捷：只要設定好PCR儀的程序，將反應體系各組分按照一定比例混合，置於PCR儀中，就可在幾個小時內完成反應。PCR產物可通過電泳分析檢測，簡單、快速、易操作、無污染。
（4）對模板質量要求不高：不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA粗製品及總RNA均可作為擴增模板。
4.PCR技術在環境檢測中的應用：
（1）環境中微生物的檢測：從環境樣品中提取核酸，然後以提取的DNA或RNA樣品為模板進行PCR擴增，隨後對PCR反應產物進行檢測與分析；
（2）在生態學中使用PCR技術：可在複雜的環境中對混合物內含量低的群體成員或生物群中某個特異基因進行檢測和研究，包括反轉錄PCR技術、競爭PCR技術、擴增的rDNA限制酶切分析技術、隨機擴增多態性DNA技術等；
（3）測定環境中致病菌和指示菌；
（4）跟蹤和檢測環境中基因工程菌株；
（5）生物製劑與化學製劑的偵檢；
（6）應用於環境微生物基因克隆工程等。
5.PCR技術存在的問題：
（1）被自然界中一些物質抑制
（2）造成假陽性結果
（三）基因差異顯示法及其在環境監測中的應用
1.基因差異顯示法：包括核酸雜交技術體系、PCR擴增技術體系、限制性酶切體系、隨機分析體系四大技術體系。
2.主要步驟：提取總RNA或mRNA，構建逆轉錄引物，分別對總的DNA進行逆轉錄，從而把mRNA分成12等份，隨後進行核酸擴增，然後測序凝膠電泳，放射白顯影，回收差異條帶，進行PCR再擴增，運用瓊脂糖凝膠電泳並回收，然後鑒定、測序。
3.基因差異顯示法的優點：
（1）引物短、出帶多，適合全部mRNA檢測；
（2）可同時比較多種細胞類型；
（3）在較短的時間內顯示出差異表達基因；
（4）可同時檢測基因的上調和下調的表達，差異顯示法為新因子的發現及對特定生物機制的研究提供了很大的方便。
4.基因差異顯示法在環境監測中的應用：
通過基因差異顯示法找到許多功能基因的特定表達，為解釋許多生命過程提供了有利的工具。隨著對於基因差異顯示法研究的不斷深入，其在環境檢測中的應用前景不可估量，尤其是在分子水平上揭示環境生物的生理生態特性中將發揮極大的作用。
（四）生物感測器及其在環境監測中的應用
1.生物感測器：
生物感測器，是一種對生物物質敏感並將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器，是由固定化的生物敏感材料作識別元件(包括酶、抗體、抗原、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性物質)、適當的理化換能器(如氧電極、光敏管、場效應管、壓電晶體等等)及信號放大裝置構成的分析工具或系統，具有接受器與轉換器的功能，包含親和型生物感測器、代謝型生物感測器、仿生生物感測器等。
2.生物感測器基本原理：
具有專一識別待測定物質功能的生物元件與待測物相遇時，發生特異的催化反應或彼此結合，產生生物信號，通過信號傳導器轉變為可輸出並加以程序化定量的電信號、光信號，檢測出待測物的量。
3.生物感測器的特點：
（1）一般不需樣品預處理，測定時不需加入其它試劑；
（2）體積小，便於攜帶，可實現連續在線監測；
（3）響應快，樣品用量少，且分子生物材料固定化，可重複使用多次；
（4）感測器連同測定儀的成本遠低於大型分析儀器，便於推廣普及。
4.生物感測器在環境檢測中的應用
（1）空氣檢驗：能快速測定空氣中甲烷、氨、CO2、SO2的含量。
（2）水體檢測：
?BOD（生物化學需氧量，目前最常用、最重要的水質有機污染評價指標，同時也是污水處理工程的重要設計參數）生物感測器：以微生物的單一菌種或混合菌種群固定在溶解氧探頭上，當加入樣品時，樣品溶液中滲透過多孔膜的有機物被固定化的微生物吸收，消耗氧，使氧電極電流隨時間急劇減小，通過對電流的測定，與標準曲線對比來測定BOD的值。
酚類微生物感測器：包括酶感測器、微生物感測器等，採用4-氨基安替比林光度法分析焦化、煉油、化工等企業廢水中酚類化合物，且測定時不受硫化物、油類等的干擾。
硝酸鹽微生物感測器：以不同的硝酸鹽還原酶做催化劑，用測定電流的生物感測器裝置來檢測硝酸鹽的含量。
陰離子表面活性劑感測器：利用當陰離子表面活性劑存在時，LAS（生活污水中烷基苯磺酸）降解菌的呼吸作用增強，引起溶解氧的變化，從而氧電極的電流變化的原理測定LAS濃度。
水體富營養化監測感測器：包括測定細胞體含有藻青素的熒光敏感藻類，進而監測水體富營養化和檢測水中葉綠素含量測定水體富營養化兩種方法。
（3）DNA生物感測器：基於DNA鹼基配對原理，探針DNA與靶標樣本的核酸發生選擇性反應，將高度專一性的DNA雜交反應與高度靈敏的電化學檢測器相結合的DNA雜交生物感測器，多用於對環境樣品中的微生物的檢測。
綜述：
生物感測器具有花費少、分析迅速、選擇性與靈敏度高、穩定性較好、能連續監測等諸多特點，隨著科學技術的不斷發展，以及相關研究的不斷深入，生物感測器在環境監測中的應用前景極為廣闊，但目前仍有一些感測器存在諸多不足急需改進。
（五）核酸基因分子探針及其在環境監測中的應用
1.核酸探針：帶有檢測標記且順序已知，與目的基因互補的核酸序列。
2.核酸基因分子探針的原理：鹼基互補的DNA鏈在適當條件下雙鏈解開，具有一定同源性的核酸單鏈與探針按照鹼基互補原則形成雙鏈雜交DNA分子，有固相雜交和液相雜交兩種類型。
3.核酸基因分子探針的應用：
（1）分析DNA序列及片段長度的多態性,在分子水平闡述分子適應等生態問環境微生物學中檢測土壤微生物多樣性檢測出所有已知細菌，同時也可能發現未知細菌。
（2）檢測水環境中的致病菌，且隨著該技術的不斷完善以及成本的不斷降低，其可能發展成為一種快速可靠並可能代替常規微生物檢驗水質的方法。
（3）可用於基因診斷與基因藥物的設計、不同基因型細胞的表徵分析、後基因組研究等。
4.核酸基因分子探針技術存在的問題：一方面，如DNA晶元上原位合成探針難免有錯誤核苷酸摻入及雜質混入，這樣可使整個雜交背景增高，降低特異性；另一方面，複雜的寡核苷酸存在的高級結構和自身配對會影響與靶DNA雜交或形成不穩定雜交二聚體，影響分析結果等。
（六）生物晶元技術及其在環境監測中的應用
1.生物晶元技術：通過微加工和微電子技術在固體晶元吧表面構建微型生物化學分析系統，從而實現對生命機體組織、細胞、蛋白質、核酸、糖類以及其他生物組分進行準確、快速、大量信息的檢測。
2.基因晶元：在基因探針的基礎上研製出的，隸屬於生物晶元，是在生物晶元技術中發展最為成熟和最先實現商品化的產品。
3.生物晶元技術在環境監測中的應用：生物晶元技術一方面可以快速檢測污染微生物或有機化合物對動植物、人體、環境的污染和危害，另一方面，可應用於農業、商檢等領域。其在病原細菌瞬時檢測、細菌基因表達水平測量、菌種鑒定、水質控制等方面均有廣泛的用途。
（七）酶聯免疫吸附技術及其在環境監測中的應用
1.酶聯免疫吸附技術：將免疫技術與現代測試手段相結合，把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化作用原理有機結合起來的一種超微量測定技術，主要包括雙抗體夾心法、競爭法、間接法等，具有簡單、快速、靈敏、穩定、特異、高通量等特點。
2.酶聯免疫吸附技術在環境監測中的應用：
（1）檢測環境中的毒素；
（2）檢測水和土壤中的農藥殘留；
（3）檢測環境中的微生物。
（八）生物標記物法及其在環境監測中的應用
1.生物標記物法：應用標記物作為診斷工具、趨勢分析參數或預測標記物，從而達到表徵、控制或預測污染物及其危害的目的。
2.生物標記物：用於監測生物暴露於環境中污染物的劑量和效應，生物體遺傳特性或誘發性敏感度的差異，以及對由環境污染物所引發的各種病變的早起診斷，具有特異性、報警作用、廣泛性等特點，分暴露標記物、效應標記物、易感性生物標記物三種類型。
3.生物標記法在環境污染監測中的應用：如（1）運用乙醯膽鹼酯酶抑制來作為鳥類和魚有機磷農藥中毒的指示等進行環境污染風險評價；（2）運用細胞色素P450檢測有機污染物等；（3）運用金屬硫蛋白誘導評價水中金屬污染物的水平；（4）運用溶酶體蝕變準確、靈敏和便捷地監測環境污染對水生生物的危害等。
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