山東大學張友明團隊在DNA大片段直接克隆技術研發上取得系列重要進展
基因克隆技術是生物學研究最基本的方法之一，基於PCR的克隆技術一般很難突破10kb。基因組文庫構建耗時費力，而且柯斯質粒（Cosmid）文庫無法克隆超過45kb的片段，細菌人工染色體（BAC）文庫雖然可以獲得大於200kb的基因組DNA，但是只有專業實驗室才能實現。直接克隆技術可以將基因組中的DNA大片段直接捕獲到載體上，避免了繁瑣的DNA文庫構建工作，意義重大。山東大學微生物技術國家重點實驗室張友明團隊長期致力於DNA直接克隆技術的研發工作，取得了一系列重要進展。
大腸桿菌λ噬菌體重組蛋白 Redα（核酸外切酶），Redβ（單鏈DNA退火蛋白）可以高效介導線性DNA和環狀DNA之間發生同源重組。張友明教授利用Red重組蛋白開發的Recombineering技術不受DNA分子大小和限制性酶切位點的制約，可以從大腸桿菌染色體上將任意大小的基因組DNA片段克隆到載體上，該技術於1998年發表在Nature Genetics【1】。
Recombineering技術還可以用於細菌染色體和質粒的修飾，是基因工程領域的一個里程碑，是DNA大分子遺傳修飾的必備技術，已經廣泛應用於真核和原核生物的基因敲除和轉基因等領域。由於Red重組蛋白介導的線環重組必需依賴於DNA複製體系，所以它只能從大腸桿菌基因組上克隆DNA片段。
為了突破基因組DNA直接克隆技術對物種的限制，山東大學符軍教授通過研究發現Rac前噬菌體重組蛋白RecE和RecT能夠高效介導線性DNA分子之間發生同源重組。基於RecET重組酶建立的DNA直接克隆技術能從純化的細菌基因組上將50kb以內的DNA片段直接捕獲到表達載體上。RecET直接克隆技術於2012年作為封面文章在Nature Biotechnology發表（圖1） 【2】。應期刊編輯邀請，美國著名合成生物學家Huimin Zhao在同期Nature Biotechnology發表了題為Direct cloning of large genomic sequences的評論。同時，Nature Methods編輯Tal Nawy博士在Nature Methods發表了題為Capturing sequences for bioprospecting的評論。RecET直接克隆技術極大地便利了微生物生物合成途徑的克隆和異源表達研究。
圖1 利用Red/ET重組技術進行基因組挖掘
為了給微生物生物合成資源的開發提供更加便利的方法，李友明課題組學生王海龍和李振將RecET系統和Redαβ系統整合到一個宿主中，並通過克隆載體和修飾元件的標準化，實現了生物合成途徑克隆、轉移和異源表達的無縫對接，一個載體可以適用於細菌接合轉移，轉座和位點特異性重組等不同遺傳操作手段，據此撰寫的詳盡實驗指導於2016年發表在Nature Protocols（圖2） 【3】。該論文得到了評審專家的高度肯定：「Before entering into the details asked by the Review, I would like to state that I really enjoyed the reading of this clever piece of science.」
圖2 生物合成途徑高通量直接克隆、轉移和異源表達。
RecET直接克隆技術的局限性在於不能從細菌基因組中克隆大於50 kb的DNA片段或者從哺乳動物（比如小鼠和人）中克隆大於10 kb的基因組片段，其原因在於RecET直接克隆技術要求克隆載體和目的基因組DNA片段必須同時進入一個大腸桿菌細胞內並相遇才能發生同源重組。王海龍圍繞如何促使克隆載體和目的DNA片段同時進入一個大腸桿菌細胞開發的ExoCET（Exonuclease Combined with RecET recombination)直接克隆技術成功實現了大於100 kb細菌基因組DNA的直接克隆，而且能高效地從小鼠和人的基因組直接克隆大於50 kb的DNA片段（下表） 【4】。
ExoCET直接克隆技術將體外重組和體內重組相結合，T4 DNA聚合酶的核酸外切酶活性可以促進克隆載體和目的基因組DNA片段在體外進行退火，從而顯著提高其共同進入一個大腸桿菌克隆宿主的幾率，細胞內表達的RecET重組酶可以將只完成了一端退火的重組DNA分子（占體外反應產物的85%）通過另一端的同源臂進行退火，從而形成完整的重組質粒。
為了探索ExoCET技術克隆宏基因組DNA的可行性，研究人員將目標細菌的基因組DNA用其它細菌的基因組DNA稀釋1000倍，成功從1 ng的目標基因組DNA中克隆了一個14kb的DNA片段，體外和體內重組相結合的威力彰顯。從小鼠基因組中克隆一個45kb的片段時，研究人員發現商業化的Gibson組裝系統會產生大量自身環化的載體而造成很高的克隆背景導致克隆失敗，但是ExoCET則可以獲得32%的克隆效率。
張友明教授團隊開發的ExoCET克隆技術不僅有利於微生物生物合成資源的開發，而且可以用於動物基因打靶載體構建和基因型分析，同時也為個體基因診斷和治療提供了新的手段，該研究成果已申請中國發明專利和PCT國際發明專利，並於2017年12月發表於Nucleic Acids Research【4】。
參考文獻：
1.Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J.P. and Stewart, A.F. (1998) A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli.Nat. Genet., 20, 123-128.
2.Fu, J., Bian, X., Hu, S., Wang, H., Huang, F., Seibert, P.M., Plaza, A., Xia, L., Müller, R., Stewart, A.F. et al. (2012) Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting.Nat. Biotechnol., 30, 440-446.
3.Wang, H., Li, Z., Jia, R., Hou, Y., Yin, J., Bian, X., Li, A., Müller, R., Stewart, A.F., Fu, J. et al. (2016) RecET direct cloning and Redab recombineering of biosynthetic gene clusters, large operons or single genes for heterologous expression.Nat. Protoc., 11, 1175-1190.
4.Wang, H., Li, Z., Jia, R., Yin, J., Li, A., Xia, L., Yin, Y., Muller, R., Fu, J., Stewart, A.F. et al. (2017) ExoCET: exonuclease in vitro assembly combined with RecET recombination for highly efficient direct DNA cloning from complex genomes.Nucleic Acids Res, 2017 Dec 2020
來源;BioArt
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