細胞培養過程中谷氨醯胺檢測方法匯總
細胞培養過程中谷氨醯胺檢測方法匯總
谷氨醯胺是一種基本的氨基酸,為其它氨基酸、脂類、細胞內蛋白質、抗體和核酸的合成提供碳源和氮源。谷氨醯胺還可刺激抗體的轉錄後翻譯過程。在許多細胞的培養過程中,均發現了細胞生長對谷氨醯胺有依賴性,如在雜交瘤細胞培養過程中,谷氨醯胺濃度為零時,細胞快速死亡。有一些細胞經過適應後,能在不含谷氨醯胺的培養基中生長,但細胞株之間的適應速率存在較大的差異。細胞生長是否依賴於谷氨醯胺的關鍵在於細胞是否含有內源的谷氨醯胺合成酶,即是否具有將谷氨酸轉化生成谷氨醯胺的能力;另外,谷氨酸的運輸速率及谷氨醯胺的生成速率限制是導致細胞在無谷氨醯胺培養基中生長速率減慢的主要原因。因此細胞培養中檢測谷氨醯胺濃度具有重大價值，本文就目前常見的谷氨醯胺的檢測方法做一個全面的匯總。主要有滴定法、HPLC、試劑盒比色、酶膜電極法、酶比色法、超高液相色譜等等方法
一、滴定法
1.原理 谷氨醯胺分子結構中既有羧基，又有胺基，但其酸鹼性都較弱，故只有在非水溶劑中才能滴定其羧基或胺基。為此，以乙酸（冰醋酸）為溶劑，用高氯酸滴定其胺基。
2.電位滴定法 稱取預先在105℃乾燥至恆重的樣品0.15g，精確至0.0001g，置於乾燥的燒杯中，加無水甲酸3mL溶解後，再加入50mL冰乙酸，用高氯酸標準溶液滴定，用電位滴定儀滴定至終點，滴定的結果用空白試驗校正。
3.指示劑法 取本品乾燥品約0.15g，精確至0.0001g，加無水甲酸3mL溶解後，加乙酸(冰醋酸)50mL，加結晶紫指示液1滴，以高氯酸標準滴定溶液(0.1mol/L)緩緩滴定至顯藍色即為終點，記錄滴定液消耗體積。
同法做空白試驗，記錄。
計算
式中： X——L-谷氨醯胺含量，%；
C——高氯酸標準滴定溶液濃度(mol/L)；
V——滴定樣品時消耗高氯酸標準滴定液體積數(mL)；
V——空白試驗時消耗高氯酸標準滴定液體積數(mL)；
m——樣品質量(g)；146.14——L-谷氨醯胺的摩爾質量（g/mol）。
4.允許誤差 平行測定結果絕對值之差不得超過0.3%；取算術平均值為分析結果。
5.高氯酸標準溶液濃度校正 當滴定樣品與標定高氯酸標準溶液時，溫度之差可超過10℃，則應重新標定高氯酸標準溶液的濃度：溫度之差不可超過10℃可按下式加以校正。
式中：C1——滴定樣品時高氯酸的濃度，mol/L；C—標定標準溶液時高氯酸的濃度，mol/L；
t1——滴定樣品時高氯酸的溫度，℃；t——標定標準溶液時高氯酸的溫度，℃；
0.0011——冰乙酸的膨脹係數
二、液相色譜法
1. 原理：通過谷氨醯胺與雙（1，1-三氟乙酸基）碘苯（BTI）反應後酸水解，再用異硫氰酸苯酯衍生後，用HPLC檢測
2. 操作步驟
2.1樣品製備 將各種乳製品稀釋10倍，進行檢測。
2.2 Gln殘基保護反應 取100μL標準肽（2.5mg/mL）或樣品溶液，加入100μL新配製的BTI乙腈溶液，並加入25μL的吡啶水溶液（50μmol/mL），混合均勻後充氮，50℃反應4h，室溫吹乾備用。
2.3 蛋白質的酸水解 向BTI處理過的樣品中加入濃度為6mol/L的HCl200μL，置於管內，高溫封管後，110℃水解24h，水解後切開封管口，室溫氮氣吹乾備用。
2.4 異硫氰酸苯脂（PITC）衍生 酸水解樣用100μL的乙腈-吡啶-三乙胺-水（10∶5∶2∶3）緩衝液溶解，氮氣吹乾後加入250μL的同樣緩衝液，並加20μL PITC，50℃反應1h後，加入正己烷200μL，混勻，封置分層，從下 層吸取200μL移入3mL樣品管中，加入2800μL稀釋液，混勻後即可上機分析。
三、試劑盒比色法
1.檢測原理：谷氨醯胺和羥胺在谷氨醯胺合成酶的作用下生成谷氨醯氧肟酸和氨，通過顯色反應可測定谷氨醯胺的含量。
2.操作步驟：
3.計算公式：
（1）.血清（漿）中谷氨醯胺的計算：
谷氨醯胺（mmol/L=（測定管OD值-空白管OD值）/（標準管OD值-空白管OD值）×標準濃度（2mmol/L）×樣本測定前稀釋倍數
（2） 組織中谷氨醯胺的計算：
谷氨醯胺濃度(mmol/gprot)*=(測定管OD值-空白管OD值)/(標準管OD值-空白管OD值)×標準濃度（2mmol/L×樣本測定前稀釋倍數÷蛋白含量（gprot/L）**
*mmol/gprot=毫摩爾/克蛋白
**gprot/L=克蛋白/升
四、酶膜電極法
1. 原理：利用谷氨醯胺合成酶能將谷氨醯胺轉變成谷氨酸和氨的特性，檢測谷氨酸的含量記為A值，再利用谷氨酸電極去檢測細胞培養液中谷氨酸的含量記為B值，A-B的差值即為細胞培養液中谷氨醯胺的含量。
2. 操作步驟 詳見儀器使用說明書
總結
在細胞培養中谷氨醯胺參與能量代謝時的脫氨反應和谷氨醯胺的自然降解導致氨的產生。多數人認為,當氨濃度大於4mmol/L時,可抑制細胞的生長,這一數據主要來自不同氨濃度條件下的細胞培養實驗。但Martineell和Hgagsrtom認為細胞代謝過程中產生的氨比培養基中添加的氨對細胞毒性更大,即使氨濃度小於4mmol/L也可能對細胞生長產生明顯的抑制作用。因此選擇一種高效、快速、簡便、準確的檢測方法成為細胞培養能否成功的關鍵因素。通過以上幾種方法的介紹我們發現滴定法具有簡單、投資小等優點，但是一般針對高純度谷氨醯胺的檢測，對於組分複雜的細胞培養液，檢測結果偏差較大；高效液相色譜作為實驗室常規儀器，實驗室必備，多數細胞實驗室可以採用該方法準確檢測谷氨醯胺濃度，但是存在操作複雜、前處理時間長等問題，嚴重製約細胞培養過程的調控和預判。
酶膜-電極法作為一種簡單、快速、準確的檢測方法，廣泛應用於臨床診斷。西爾曼科技公司作為一家創新型公司推出了M100、M800、M900等不同規格、配置的產品來滿足不同客戶的需求。酶電極法可以在20秒內檢測出細胞培養液中谷氨醯胺的濃度，誤差和準確性在2%以內，單次檢測成本只有0.18元，是細胞培養過程生化指標檢測的理想之選。
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