mRNA的胞內研究技術路線，反手就是一個贊

眼看就要過年了，老闆交給你的標書完成了嗎？實驗方案搞定了嗎？為了過一個祥和沒有壓力的春節，過一個沒有老闆催命、沒有科研處騷擾的安心年，說什麼也要在年前搞定。

RNA也分為很多種了，像miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA等，前面也有蠻多的文章介紹過了，咱們今天主要介紹mRNA的研究路線。

mRNA的研究也分細胞外和細胞內，細胞外的研究技術很多，咱們今天了解一下mRNA的細胞內研究技術和策略：轉錄、成熟、出核、翻譯、降解。

mRNA的一生其實很短暫，從基因轉錄開始，到RNA前體分子加工成熟，出核到胞質中，在核糖體中翻譯成蛋白，然後被RNase降解，完成了使命。

（1）硬技術介紹

1. 細胞固定後mRNA胞內顯影

技術：smFISH、branched DNA FISH、Sequential hybridization smFISH

單分子熒光原位雜交（smFISH）

普通FISH只能定性，而定量版本就是smFISH，它是一種新的RNA定量分析方法，能報告轉錄本丰度和空間定位，。

Branched DNA FISH

這個技術就是設計一些一級DNA探針的二級探針，加強熒光信號

MERFISH

MERFISH是一個高度多重化的smFISH成像方法，可以在單個細胞中鑒定數千種RNA的拷貝數和空間定位。該技術使用組合標籤、連續成像等技術來提高檢測通量，可謂高逼格的FISH技術。

2. 活細胞RNA胞內顯影

活細胞中RNA要實時觀測，這裡面也需要進行熒光顯色，和「固定」狀態的細胞內RNA觀測不同，活細胞狀態下不能影響RNA的翻譯，所以探針需要針對非翻譯區。

Molecular beacons

這種設計是很聰明的，首先合成互補的DNA探針，然後一端載入熒光基團，另外一端載入淬滅劑，而DNA探針末端有2、4個鹼基互補，這樣在天然狀態下，該探針是沒有熒光的，只有探針和RNA結合後，才會發光顯影。

Spinach-like aptamers、Stem-loop labeling

這兩種技術都採用發光基團（熒光素）和探針分開的策略，先讓探針滲透到細胞中結合，然後加熒光素進去結合，最後發光的條件性發光的策略，一般設計探針時放在非翻譯區。

（2）一條mRNA的一生：轉錄、成熟、出核、翻譯、降解

動態變化就是時間軸和空間分布上mRNA的變化。

轉錄起始監控：

酵母細胞從葡萄糖培養液到半乳糖培養液環境中，GAL基因群會激活表達，這叫做條件表達。

GAL1 smFISH顯示半乳糖培養液中的某些細胞的GAL1開始大量表達，而常規基因DOA1的表達模式是一成不變。

藍色的是DAPI，紅色的是mRNA

mRNA出核：

這裡有個概念，那就是mRNA出核並不是單獨出核，而是需要形成mRNP（信使核糖核蛋白體），轉運到核膜孔，這裡用Spinach-like aptamers、Stem-loop labeling、Molecular beacons方法顯示mRNA的位置，而同時需要使用核膜孔蛋白的抗體，顯示mRNA已經在核膜孔上了。

紅色是核膜孔蛋白、綠色是mRNA

mRNA的翻譯過程：

這裡還是要用到Spinach-like aptamers、Stem-loop labeling、Molecular beacons以及觀察新生蛋白的Suntag技術。

紅色是未開始翻譯的RNA，綠色是翻譯的蛋白，翻譯中的蛋白是黃色的

SunTag實質上是一套分子掛鉤，能夠將多個拷貝的生物活性分子特異性地掛到可用來靶向一些基因或其他的分子的蛋白質支架上，用來檢測特異蛋白的翻譯情況。利用SunTag顯著放大了通常用來標記細胞內分子綠色熒光蛋白的發光信號。這樣獲得的信號非常之強，因為通過顯微鏡觀察，可追蹤分子馬達中的單個分子。

胞外研究mRNA那就太多技術了，想Q-PCR、RNA-seq、RIP、RNA pulldown等，技術路線中最重要的一個環節就是RNA的加工過程，胞內胞外的技術知道一點是大有裨益的。

P.S.胞內研究分子時，試劑小分子進入胞內的效率是一種非常嚴重的問題，因為需要保證小分子能充分大量進入胞內才可行。

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