Lactobacillusplantarum苯丙酮酸還原酶的異源表達及其在苯乳酸製備中的應用

袁風嬌1,李雪晴1,李劍芳1,劉艷1,鄔敏辰2*

1 (江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 2 (江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫，214122)

摘 要構建產苯丙酮酸還原酶的基因工程菌E.coli/ppr，優化其目的蛋白表達條件，並利用全細胞催化製備光學純的D-苯乳酸。以Lactobacillusplantarum的基因組DNA為模板，經PCR擴增出一種編碼苯丙酮酸還原酶的基因 (ppr)，並將其在大腸桿菌BL21中進行表達。以苯丙酮酸為底物，通過單因素和正交試驗優化誘導表達條件，然後對E.coli/ppr全細胞製備苯乳酸的工藝進行研究。結果表明：E.coli/ppr在IPTG終濃度為0.5 mmol/L，20 ℃誘導8 h時具有最高的苯丙酮酸還原酶活性。由其催化製備苯乳酸的最佳條件為：反應溫度40 ℃，反應初始pH 6.5，葡萄糖濃度20 mmol/L。在上述條件下增加苯丙酮酸的濃度至25 mmol/L，5 h後苯乳酸的最終產率達到98.4%，產物D-苯乳酸光學純度eegt;99.9%。

關鍵詞苯丙酮酸還原酶；表達；苯乳酸；條件優化；全細胞催化

苯乳酸 (phenyllactic acid, PLA) 是一種新型的天然防腐劑，主要存在於蜂蜜和乳酸菌發酵製品中，具有較為寬廣的抑菌譜，對大多數細菌和真菌均有明顯的抑制作用[1-3]。與其他生物防腐劑相比，苯乳酸具有分子量低、親水性強，能夠在各種食品體系中均勻擴散等優點，因此作為廣譜抑菌劑其應用前景十分廣闊[1]。此外，還可以通過聚合反應將苯乳酸聚合成為聚苯乳酸，可作為一種潛在的替代聚乳酸的新型高分子材料，廣泛應用於製藥工程、組織工程和高分子材料等領域[4]。

苯乳酸可由多種微生物發酵而來，LAVERMICOCCA等[2]通過對酸麵糰中乳酸菌菌群進行抗真菌能力的研究，首次從1株Lactobacillusplantarum21B的發酵液中檢測出苯乳酸。MU等[5-6]通過對發酵培養基的優化和恆定pH流加培養，Lactobacillussp. SK007產苯乳酸的量從2.42 g/L上升到17.38 g/L，產率和轉化率分別達到0.241 g/(L·h)和51.1%，這是目前通過發酵法生產苯乳酸的最高紀錄。RODRIGUEZ等[7]對5株發酵產生苯乳酸的乳酸菌進行研究，其中L.plantarumCECT-221苯乳酸的產量最高，以苯丙氨酸為底物對培養條件進行優化，在2 L的發酵罐中發酵培養158 h，產量由原來的0.23 g/L上升到0.7 g/L。隨著研究的深入，多種來自不同家族的脫氫酶類被發現具有轉化苯丙酮酸製備苯乳酸的活性，大部分來自乳酸菌，包括D和L兩種構型[8-11]。苯丙酮酸還原酶是微生物合成苯乳酸的一種重要酶[11]，基於苯乳酸較強的抑菌性能，篩選產酶活性較高的菌株，挖掘其能夠產生高活性及高選擇性的苯丙酮酸還原酶基因，生產純度好、抑菌活性強的苯乳酸是未來研究亟待解決的問題。

由於乳酸菌 (Lactic acid bacteria, LAB)是公認為安全 (Generally Recognized As Safe, GRAS)的微生物，千百年來用於食品加工、保藏，更適於工業化生產。本研究選擇Lactobacillusplantarum作為原始菌株，將來自Lactobacillusplantarum的苯丙酮酸還原酶 (phenylpyruvate reductase, ppr) 克隆表達至大腸桿菌E.coliBL21中，構建重組工程菌E.coli/ppr。以苯丙酮酸為底物，通過重組全細胞催化對目的蛋白誘導表達條件及苯乳酸的製備條件進行優化，旨在為進一步提高微生物合成苯乳酸的產率和底物轉化率提供借鑒。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 質粒和菌株

Lactobacillusplantarum、大腸桿菌 (E.coli) JM109、BL21(DE3) 和表達載體pET-28a(+)：由作者所在實驗室保藏；克隆載體pUCm-T：購自上海Sangon公司；重組質粒pUCm-T-ppr和pET-28a-ppr由本實驗室構建和保藏。

1.1.2 主要試劑

SanPrep DNA膠回收試劑盒：購自上海Sangon公司；rTaqDNA聚合酶、限制性內切酶、T4DNA連接酶、DNA和蛋白質Marker：購自大連TaKaRa公司；D,L-苯乳酸標準品和苯丙酮酸標準品：購自上海Sigma公司；其他試劑均為國產或進口分析純。

1.2方法

1.2.1 引物設計

根據NCBI中已知的L.plantarumD-苯丙酮酸還原酶基因 (D-ppr) 序列 (GenBank: LUXK01000001.1) 設計特異性引物如表1所示，由上海Sangon公司合成。

表1擴增苯丙酮酸還原酶基因的引物

Table1PCRprimersfortheamplificationofphenylpyruvatereductasegenes

註：下劃線為酶切位點。

1.2.2 重組表達質粒的構建

以提取的Lactobacillusplantarum的基因組DNA為模板擴增出目的基因 (ppr)，PCR產物經1%凝膠電泳檢測。將割膠回收的目的基因片段連接至pUCm-T載體上，轉化E.coliJM109感受態細胞中。經藍白斑篩選及菌液PCR鑒定後獲得陽性克隆子E.coliJM109/pUCm-T-ppr，並送往上海Sangon公司測序。將測序正確的轉化子用NdeI和NotI雙酶切，經割膠回收穫得目的基因ppr，與同樣經雙酶切的表達質粒pET-28a(+) 連接，並轉化至E.coliBL21，經菌液PCR驗證，獲得重組大腸桿菌E.coli/ppr並送往上海Sangon公司進行測序。

1.2.3 苯丙酮酸還原酶誘導表達條件優化

分別挑取測序正確E.coli/pET-28a、E.coli/ppr和E.coliBL21的單菌落接種於2 mL LB液體培養基，37 ℃、220 r/min培養12～14 h。按2%的接種量 (體積分數) 轉接入100 mL LB培養基中，37 ℃、220 r/min培養至OD600值為0.6～0.8，添加IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，於25 ℃、220 r/min誘導8 h。離心收集細胞，用磷酸鹽緩衝液 (100 mmol/L、pH 7.0) 製備一定濃度的菌懸液，用於SDS-PAGE分析。

採用單因素試驗考察誘導溫度、誘導劑濃度及誘導時間對全細胞合成苯乳酸的影響。重組大腸桿菌初始誘導條件為：添加IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，25 ℃誘導8 h。根據單因素試驗結果，設計3因素3水平的正交試驗優化誘導表達條件 (如表2)。

表2正交實驗因素水平表

Table2Factorsandlevelsoforthogonaltest

1.2.4 高效液相色譜分析方法

反相色譜柱型號: ProntoSIL C18AQ(4.6 mm×250 mm，5 μm)；優化後的HPLC條件為：流動相為均含有0.05%的三氟乙酸的甲醇 (A) 和水 (B) 的混合液，梯度洗脫程序為：0～15 min由20%A線性變化至65%A，15～16 min由65%A線性變化至100%並保持3 min，19～20 min由100%A線性變化至20%，流速1 mL/min，進樣量為10 μL，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃。

通過正相HPLC分析苯乳酸的構型，正相色譜柱型號：Chiralcel OD-H (0.46 mm×250 mm，5 μm)，流動相為含有0.05%三氟乙酸的正己烷/異丙醇 (98∶2) 混合液，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，檢測器為紫外檢測器，波長為210 nm，柱溫30 ℃。

1.2.5 重組大腸桿菌全細胞催化製備苯乳酸的工藝優化

在優化誘導表達條件的基礎上，進一步考察pH、反應溫度和葡萄糖濃度等因素對轉化苯丙酮酸合成苯乳酸工藝的影響。初始轉化條件為：pH 7.0，細胞濕重50 g/L，底物濃度10 mmol/L，葡萄糖濃度50 mmol/L，反應溫度37 ℃，反應時間為20 min。

2 結果與討論

2.1重組表達質粒的構建

以L.plantarum的基因組DNA為模板擴增出目的基因 (ppr)，經T4DNA連接酶連接至pUCm-T，轉化E.coliJM109，經藍白斑篩選、菌液PCR驗證篩選出陽性轉化子並送往上海sangon測序。分別提取測序正確的轉化子及E.coli/pET-28a的質粒，經NdeI和NotI雙酶切後回收酶切產物，連接後轉化至E.coliBL21感受態細胞。從轉化子中提取重組質粒DNA利用通用引物進行PCR驗證，獲得大小約為1 400bp的片段 (如圖1-a)，與預期相符。同時，將提取的重組質粒進行雙酶切驗證獲得大小分別為5 300 bp和1 000 bp的片段 (如圖1-b)，與理論值相符。將驗證正確的轉化子命名為E.coli/ppr，保藏並用於後續實驗。

M:DNA Marker；(a)1-2:苯丙酮酸還原酶基因的PCR驗證；(b)1-2:重組質粒的雙酶切驗證

圖1 重組大腸桿菌E. coli/ppr的驗證

Fig. 1 Identification of recombinant bacterium E. coli/ppr

2.2重組大腸桿菌的表達及SDS-PAGE分析

對經IPTG誘導後重組大腸桿菌E.coli/ppr、E.coli/pET-28a及原始菌株E.coliBL21進行SDS-PAGE電泳分析，結果如圖1所示。與對照菌株相比，E.coli/ppr在約41.3 kDa處有明顯條帶，除去質粒上融合表達的融合標籤，與預測目標蛋白大小一致，表明來自Lactobacillusplantarum的ppr在大腸桿菌中成功表達。

M:標準蛋白Marker；1:原始菌株；2:空質粒菌株；3:重組菌株

圖2 SDS-PAGE分析苯丙酮酸還原酶蛋白表達

Fig.2 The analysis of phenylpyruvate reductase protein by SDS-PAGE

2.3HPLC檢測重組大腸桿菌E.coli/ppr全細胞催化製備苯乳酸

全細胞轉化實驗表明，重組大腸桿菌E.coli/ppr具有明顯的催化苯丙酮酸製備苯乳酸的能力，在37 ℃、220 r /min條件下轉化20 min，10 mmol/L PPA經50 mg/mL (濕重) 重組大腸桿菌E.coli/ppr轉化還原為4.35 mmol/L苯乳酸，底物、產物標品及樣品的HPLC檢測結果如圖3-a。通過正相HPLC分析苯乳酸的構型檢測結果如圖3-b所示，經計算產物D-苯乳酸光學純度eegt;99.9%。

圖3 HPLC分析重組大腸桿菌全細胞轉化合成苯乳酸

Fig.3 HPLC analysis of PLA production by whole cells of recombinant E. coli

2.4重組大腸桿菌誘導條件的優化

2.4.1 誘導溫度對全細胞合成苯乳酸的影響

如圖4-a所示，隨著誘導溫度的升高，苯乳酸的產量逐漸升高，而當溫度高於20 ℃時，苯乳酸的產量迅速下降。可能是由於低溫條件下，宿主菌體生長少，異源蛋白表達量低；溫度較高時，宿主菌體生長量大，異源蛋白合成速率高，但高水平表達異源蛋白會影響其正確摺疊而形成無活性的不溶性包涵體。另外，收集37 ℃誘導條件的菌體經超聲破碎，離心收集上清液和沉澱，分別進行SDS-PAGE和酶活力分析。破碎上清液中無重組苯丙酮酸還原酶的目的條帶且無活性，而沉澱在41.3 kDa處出現明顯目的蛋白條帶 (圖略)，表明重組蛋白在該條件下形成包涵體。因此，選定20 ℃為最佳誘導溫度進行後續優化。

2.4.2 IPTG濃度對全細胞合成苯乳酸的影響

目的基因插入表達質粒pET28a(+) 的上游，T7啟動子的下游，可以通過加入IPTG來誘導其表達。IPTG可調節異源蛋白的表達水平，促進包涵體的形成，並抑制大腸桿菌的生長[12]。如圖4-b所示，在IPTG濃度為0.5 mmol/L時，苯乳酸產量最高，故選定0.5 mmol/L為最佳誘導濃度進行後續優化。

2.4.3 誘導時間對全細胞合成苯乳酸的影響

如圖4-c所示，苯乳酸的產量隨著誘導時間延長而增加，誘導時間大於8 h時，其產量略微降低但穩定在80%左右，可能是由於誘導時間延長，大腸桿菌進入衰亡期，產酶速率低於被蛋白酶降解的速率，從而導致活性降低。當誘導時間為8 h時，重組酶活力最高，故選定8 h為最佳誘導時間進行後續優化。

圖4 誘導表達條件優化

Fig.4 Optimization of induction condition

2.4.4 正交試驗結果分析

根據上述單因素試驗結果，設計3因素3水平的正交試驗，研究各因素和水平之間的的相互關係。如表3所示，極差分析表明影響重組大腸桿菌產酶因素的重要性次序為：誘導溫度(A)gt;誘導時間(C)gt;IPTG濃度 (B)，其中誘導溫度對苯乳酸的產量影響最大，IPTG濃度影響較小。故採用最佳的誘導條件為誘導溫度20 ℃，IPTG終濃度0.5 mmol/L，誘導時間8 h，經驗證後苯乳酸的產量達到7.85 mmol/L。

2.5全細胞生物催化合成苯乳酸的單因素試驗

2.5.1 反應溫度對合成苯乳酸的影響

全細胞催化反應其本質仍是酶促反應，因此溫度也是影響全細胞催化反應的主要因素之一。在pH 7.0的反應體系下考察不同反應溫度 (20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃) 對苯乳酸產量的影響。從圖5-a可以看出，隨著溫度的升高，苯乳酸的量也逐漸升高，當溫度達到40 ℃時，其產量達到最大，繼續升高溫度，苯乳酸的產量出現下降的趨勢，原因可能是溫度升高細胞膜的傳質阻力減小，酶與底物間的有效碰撞增多，合成的產物也能更快滲透到胞外，但過高的溫度會導致反應中的酶發生失活，催化反應速率隨之降低。因此，本實驗選擇40 ℃作為苯乳酸合成的最佳反應溫度。

表3正交試驗結果分析表

Table3Theanalyticalresultsbytheorthogonaldesign

2.5.2 反應體系pH對苯乳酸合成的影響

轉化體系的pH值是影響生物催化反應的重要因素之一。本實驗中設置轉化緩衝液pH分別為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，其他試驗條件同1.2.5，考察不同pH的反應體系對苯乳酸合成的影響，結果如圖5-b所示。從圖中可以看出，隨著反應體系pH值的增大，合成苯乳酸的量也逐漸增大，當pH達到6.5時，苯乳酸的產量達到最高，繼續增加反應體系的pH值，苯乳酸產量反而出現了下降，這可能是因為過高的pH值抑制了酶的活性，導致苯乳酸合成反應受阻。因此，選擇pH 6.5為催化合成反應的最佳pH值。

2.5.3 反應體系中葡萄糖濃度對苯乳酸合成的影響

來自Lactobacillusplantarum的苯丙酮酸還原酶是NADH依賴型的還原酶，在轉化苯丙酮酸的過程中，需要輔酶NADH的參與，通過胞內輔因子再生系統提高反應體系中NADH的濃度是提高苯乳酸產量的一種有效途徑。葡萄糖作為常用的一種相對廉價的碳源，常作為輔助底物用於輔因子再生，維持胞內的氧化還原環境[13]。本研究考察了不同葡萄糖濃度 (0、20、40、60、80、100 mmol/L) 對苯乳酸合成的影響，其他條件同1.2.5，結果如圖5-c所示。當加入20 mmol/L葡萄糖時，苯乳酸的產量顯著增加。但隨著葡萄糖濃度的增加，苯乳酸的產量增幅較小，因此，反應體系中葡萄糖的濃度為20 mmol/L時最佳。

圖5 全細胞轉化條件優化

Fig.5 Optimization of bioconversion conditions

2.6進程曲線的測定

在以上最佳條件下測定反應的進程曲線，即反應溫度40 ℃，反應體系pH為6.5，添加葡萄糖的量為20 mmol/L，並增加底物濃度至25 mmol/L。在此條件下轉化需要5 h，最終轉化率為98.38%。ZHANG等[14]對BacilluscoagulansSDM全細胞催化生產苯乳酸的工藝進行研究，在最優條件下通過底物流加反應20 h後苯乳酸的產量達到37.3 g/L，轉化率為70%。LI等[15]研究表明LeuconostocmesenteroidesATCC 8293生長細胞轉化合成苯乳酸的最佳底物濃度為35 mmol/L，轉化率為75.2%～83.3%。本研究獲得的重組工程菌相比於原始菌株具有轉化體系簡單，轉化率高，轉化速率快等優點，為苯乳酸的大規模生產及工業化應用奠定了基礎。

圖6 重組大腸桿菌E. coli pET-28a-ppr催化產生苯乳酸的進程曲線

Fig.6 Time course production of PLA by the recombinant E. coli pET-28a-ppr

3 結論

本研究以重組大腸桿菌濕菌體為全細胞催化劑，通過單因素實驗及正交實驗對目的蛋白的誘導表達條件進行優化，在此基礎上對重組大腸桿菌全細胞轉化苯丙酮酸製備苯乳酸的條件進行優化。優化後的最適條件為轉化溫度為40 ℃，轉化體系最初pH為6.5，葡萄糖濃度為20 mmol/L。在最佳反應條件下，增加底物的濃度至25 mmol/L，經過5 h反應後，苯乳酸產量達到4.15 g/L，轉化率為98.38%，轉化率和產量都遠遠大於通過發酵法生產苯乳酸的量。結果表明基因工程技術結合全細胞轉化方法是一種高效可行的合成苯乳酸的途徑。另外，採用全細胞催化合成苯乳酸，無需破碎細胞，工藝大大得到簡化，同時，還減少了反應雜質，為後續苯乳酸的分離純化提供了有利的條件。

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Heterologous expression of phenylpyruvate reductase fromLactobacillusplantarumand its application in the preparationof phenyllactic acid

YUAN Feng-jiao1, LI Xue-qing1, LI Jian-fang1, LIU Yan1, WU Min-chen2*

1(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Wuxi Medical School, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACTIn order to construct a genetic engineering phenylpyruvate reductase strain (E.coli/ppr), the expression conditions and bioconversion medium were optimized to increase the production of PLA with whole-cell transformation. A phenylpyruvate reductase-encoding gene,ppr, was obtained by PCR from the genomic DNA ofLactobacillusplantarumand heterologously expressed inE.coliBL21 (DE3). Taking phenylpyruvic acid as the substrate, single factor and orthogonal experiments was used to optimized the induced expression and whole-cell catalysis conditions. Results showed that after induction with 0.5 mmol/L IPTG at 20 ℃ for 8 h,E.coli/pprdisplayed the highest LpPPR activity. When phenylpyruvic acid was added up to 25 mmol/L, the product enantiomeric excess percent was over 99.9% and the final yield of PLA could reach 98.38% at 5 h under the optimal catalytic conditions as follows: temperature 40 ℃, initial pH 6.5 and 20 mmol/L glucose.

Key wordsPhenylpyruvate reductase; expression; phenyllactic acid; optimization; whole-cell catalysis

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015007

收稿日期：2017-06-22，改回日期：2017-07-13

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