CRISPR-dCas9-表觀遺傳調控系統

引言

表觀遺傳調節是往往是通過影響一段染色質的結構起作用，比如將染色質壓縮成緊密狀態（異染色質），使基因難以轉錄，或者使染色質打開以促進轉錄。表觀遺傳調節包括DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙醯化、組蛋白磷酸化等等。

最近，人們將dCas9與表觀遺傳修飾酶融合在一起，形成dCas9表觀遺傳編輯系統，該系統成員如表1所示。

Table 1 - The dCas9Epigenetics Toolbox

dcas9-組蛋白修飾

dCas9-p300表觀遺傳激活系統（組蛋白乙醯化系統）

組蛋白乙醯化是最強大的基因表達增強子系統之一。dCas9-p300的開發，使得人們能夠直接改變靶標基因附近的染色質狀態。在這個系統中，人類E1A相關蛋白p300的催化核心與dCas9融合，這是組蛋白乙醯化的關鍵成分。

當靶向編碼區或啟動子區時，這個系統可成功誘導基因高表達。特別是，當靶向啟動子或增強子時，基因表達可增強50至10,000倍。通過轉錄組分析評估得到，基因激活是高度特異性的。這表明該系統可以精確調控某段染色質的變化。

dCas9-p300是一種簡單而獨特的工具，可用於研究調控元件和靶基因表達之間的複雜關

系。

Figure 4 – ThedCas9-p300 system for epigenetic activation. a) dCas9 fused to the corecatalytic domain of p300 can acetylate target sites in the genome. Acetylationof the target gene synergizes withthe action of transcription factors and RNAPolymerase II, resulting in transcriptional upregulation. Adapted from Figure 1bof Zentner et al. (2015). b) Comparison of relative expression levels of IL1RNwhen dCas9 by itself vs. dCas9 fused to the p300 catalytic core is targeted tothe IL1RN promoter. Relative expression levels determined by qRT-PCR. Adaptedfrom Figure 1c of Hilton et al. (2015).

dCas9-LSD1表觀遺傳抑制系統（組蛋白去甲基化系統）

dCas9-LSD1是dCas9-p300激活系統的互補基因抑制系統。在該系統中，dCas9與賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（LSD1）融合（圖5a）。 Kearns等人在穩定表達dCas9-LSD1的小鼠胚胎幹細胞系中，設計Oct4基因的遠端增強子區域的gRNA，Oct4基因被抑制。

然而，當dCas9-LSD1針對Oct4啟動子時，沒有觀察到效果。這使得dCas9-LSD1成為研究增強子調控活性的工具。這與其他系統如dCas9-KRAB（它們是更全面的基因表達控制器）互補。當靶向上游增強子時，dCas9-LSD1也能夠使下游基因表達沉默（圖5b），而不破壞基因組結構。

由於在增強子區域內發現了與人類疾病相關的許多基因組區域，因此dCas9-LSD1以高度特異的方式功能性地靶向增強子元件的能力使其在定義增強子 - 基因關係方面具有無價之寶。當與增強子靶向的sgRNA池組合使用時，該系統可以提供高通量的方式來鑒定與基因相關的所有增強子。

Figure 5 – ThedCas9-LSD1 system for epigenetic repression. a) dCas9 fused to LSD1 candemethylate target sites in the genome. Demethylation of the target generesults in transcriptional downregulation. Adapted from Figure 1b of Zentner etal. (2015). b) The relative expression level of the TBX3 gene was assessed viaquantitative PCR analysis when the sgRNA of the dCas9-LSD1 system was fusedwith a distal enhancer vs. a promoter. sgRNAs specific to an unrelated genomicregion were used as controls. Adapted from Figure 1e of Kearns et al. (2015).

dCas9-DNA甲基化修飾

dCas9-Tet1-CD –dCas9-DNA去甲基化修飾系統

哺乳動物細胞中的靶向DNA甲基化主要發生在CpG二核苷酸序列內胞嘧啶的第五個碳上。細胞發育，分化和腫瘤都可以通過DNA甲基化來調節，高甲基化與癌症和神經系統疾病密切相關。使DNA甲基化易於調節的技術可以直接探索甲基化狀態和基因表達之間的功能關係，甚至可以開發治療疾病的療法。

dCas9-Tet1-CD是以這種方式編輯表觀基因組的新技術之一。該系統由與Tet1（十 - 十一易位甲基胞嘧啶雙加氧酶1）的催化結構域融合dCas9組成，該酶觸發DNA去甲基化（圖6a）。伴隨的sgRNA也可以進行修飾，使之包含一個MS2二聚體，每個二聚體再與兩個Tet1-CD模塊融合。

有研究表明，該系統轉染後4天後觀察到基因的激活（圖6b）。在不同的人和小鼠細胞系中，結合精確的sgRNA設計和控制該系統不同組分的比例，dCas9-Tet1-CD系統及其伴隨的MS2-Tet1-CD系統能夠在特定位置有效去甲基化，且具有很小的脫靶效應。

dCas9-Tet1-CD系統地靶向特異性將幫助科學家輕易地探索特定基因啟動子靶點甲基化對下游基因的影響。最近，dCas9-Tet1-CD系統結合常規sgRNA也被用於靶向BRCA1啟動子的表觀遺傳修飾，BRCA1是一種腫瘤抑制基因，其過度甲基化沉默與非家族性乳腺癌和卵巢癌相關[15] 。這樣的系統也可以用來恢復其他腫瘤抑制基因的功能活性。

Figure 6 – ThedCas9-TET1-CD system for targeted DNA demethylation. a) dCas9 is fused to thecatalytic domain of TET1 (TET1-CD). The accompanying sgRNA is additionallymodified to contain two RNA aptamers that recruit MS2 coat proteins, each fusedto a TET1-CD. Adapted from Figure 1a of Xu et al. (2016). b) qRT-PCR was usedto assess mRNA levels of RANKL gene expression using two sgRNAs designed totarget the RANKL promoter region (-800 bp upstream of transcription startsite). Adapted from Figure 2c of Xu et al. (2016).

dCas9-DNMT3A—dCas9-DNA甲基化修飾系統

與基於組蛋白的細胞表型控制不同，DNA甲基化對基因表達的作用更穩定和長期。基於dCas9的甲基化系統不僅具有跨物種能力，而且對CpG甲基化不敏感。

dCas9-DNMT3A是先前討論的dCas9-Tet1-CD系統的甲基化對應物。由Vojta等開發，該系統是dCas9（通過靈活的Gly4Ser接頭）與DNMT3A的催化結構域（一種能夠在體內甲基化CpG位點的活性DNA甲基轉移酶）融合。這個dCas9-DNMT3A系統在HEK293細胞中成功地誘導BACH2啟動子上游和下游的位點特異性CpG甲基化，最高濃度的甲基化活性（60％）位於PAM序列下游27bp處。當針對IL6ST啟動子時，轉染後10天後兩種基因的表達水平均顯著降低。

此外，通過dCas9-DNMT3A與sgRNA池結合同時靶向多個基因特異性位點導致甲基化的協同作用，將甲基化提高2倍，擴大該系統的基因沉默能力。

自其發展以來，dCas9-DMNT3A也被用於多種癌症相關的腫瘤抑制基因（18）的啟動子的

甲基化如（CDKN1A和2A啟動子甲基化）。該項研究表明，CDKN1A啟動子的甲基化導致CDKN1A的表達下降和細胞增殖能力的增加（19），進一步證明了該系統用於功能基因組學研究。

Figure 7 – ThedCas9-DNMT3A system for targeted DNA methylation. a) dCas9 is fused to thecatalytic domain of DNMT3A. In vivo, DNMT3A recruits a partner for dimerizationalong with DNMT3L proteins (shown in dashed red box and ovals, respectively).Adapted from Figure 1a of Vojta et al. (2016). b) RT-qPCR analysis of IL6STgene expression via dCas9-fused to active DMNT3A. Expression levels induced bydCas9 fused to inactive DMNT3A along with dCas9 accompanied by non-targetingsgRNAs were measured as negative controls. Fold change is relative tomock-transfected cells. Adapted from Figure 4a of Vojta et al. (2016).

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