《Science》子刊：CRISPR再入新領域！肌營養不良症的基因治療或可成真！

新聞 02-04

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CRISPR

導讀

以CRISPR/Cas9為基礎的基因編輯技術在艾滋病、血液病、腫瘤等多種遺傳性疾病的基因治療領域中展現出極大的應用前景。杜氏肌營養不良是一種X染色體隱性遺傳疾病，醫學界尚無有效療法。近日，有研究人員指出，CRISPR/Cas9可用於杜氏肌營養不良症的基因治療，打破該病無葯可治無法可醫的局面。

杜氏肌營養不良是一種X染色體隱性遺傳疾病，主要發生於男孩。據統計，全球平均每3500個新生男嬰中就有一人罹患此病。患者在學齡前就會因骨骼肌不斷退化出現肌肉無力或萎縮，導致不便行走。大概在7歲到12歲時，會徹底喪失行走能力，通常到20多歲就會因為心肌、肺肌無力而死亡。針對該病，醫學界尚無有效療法。

近日，德克薩斯大學西南醫學中心的研究人員發現，CRISPR/Cas9可用於杜氏肌營養不良症的基因治療，並進行了概念實驗驗證。該研究結果以《Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing》為題發表在1月31日的《Science Advances 》上。

造成杜氏肌營養不良（DMD）的X-連鎖肌營養不良蛋白基因（DMD）能發生3000種不同突變，這些突變大部分與心臟和骨骼肌壞死有關。研究人員利用CRISPR 在DMD發生突變或缺失的患者的誘導多能幹細胞中進行了編輯，成功使衍生心肌細胞的肌養蛋白恢復了表達。在三維設計的心肌模型（EHM）中，CRISPR 的編輯使DMD突變的肌動蛋白修復，肌養蛋白重新表達，還使肌肉的機械收縮力恢復，糾正DMD後的EHM收縮功能得到了恢復。他們發現，僅糾正一小部分心肌細胞（30-50％）就足以將突變的EHM表型恢復至正常水平。

CRISPR使DMD突變的衍生心肌細胞肌養蛋白mRNA重新表達

免疫組化和蛋白印跡分析顯示肌養蛋白重新表達

研究團隊通過CRISPR / Cas9的基因組編輯，利用同源性定向修復法（HDR）修復了肌營養不良症模型鼠(mdx小鼠)的生殖系統及肌肉乾細胞中的DMD點突變，並通過末端連接（MMEJ）修飾了該小鼠的肌肉組織，最終，小鼠的肌營養不良癥狀顯著改善。然而，大多數DMD患者存在一個或多個外顯子的缺失，僅有5-9％的DMD患者具有點突變，因此，僅僅修正這點突變並不能直接說明CRISPR / Cas9基因組編輯適用於人類的DMD異質性突變。

改善後的DMD心肌細胞所衍生出的EHM顯示收縮力得到增強

隨後研究人員發現，DMD突變聚集在基因特定的「熱點」區域（外顯子45-55和外顯子2-10），因此，只要繞過「熱點」附近的12個外顯子重建基因框架就可以挽救大部分DMD患者（約60％）的肌蛋白功能。他們使用帶有引導RNA的CRISPR / Cas9，破壞DMD突變的保守剪接受體和供體位點，使周圍外顯子繞過「熱點」區域重建框架，從而使DMD突變得到修復。因此，研究人員認為CRISPR / Cas9的基因組編輯技術能成為糾正DMD相關的肌肉和心臟異常的有力手段。研究數據進一步表明，EHM作為是一個合適的臨床前工具，可有效提高基因編輯的效率。

可繞過「熱點」附近12個外顯子的引導RNA

目前，人體CRISPR臨床試驗已經在中國和美國獲得批准。但是，由於脫靶效應可能使基因組產生突變，因此，CRISPR / Cas9系統的一個關鍵問題是解決引導RNA的特異性，現已開發了評估可能的脫靶效應的方法。另外，也已報道了能夠使潛在的脫靶效應改善的新方法。但是，全面廣泛的脫靶效應分已經超出了此研究的範圍，因此，此項療法在進行臨床治療之前，應對各個引導RNA可能的脫靶效應進行徹底的評估。

參考資料：Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing

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