Cell Stem Cell：利用CRISPR修飾表觀基因組產生誘導性多能幹細胞

在一項新的研究中，來自美國斯坦福大學、格拉斯通研究所和中國清華大學的研究人員報道，一種能夠激活而不是切割DNA的CRISPR形式能夠將胚胎小鼠細胞轉化為誘導性多能幹細胞（induced pluripotent stem cell, ipsC）。相關研究結果於2018年1月18日在線發表在Cell Stem Cell期刊上，論文標題為「CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency」。

小鼠胚胎成纖維細胞，圖片來自Bozonhiggsa/Wikimedia。

美國紐約基因組研究所生物工程師Neville Sanjana（未參與這項研究）寫道,「這篇論文證明了CRISPR效應分子不僅能夠激活單個基因，而且完全重塑細胞的轉錄狀態。」

為了產生iPSC，科學家們過表達4種轉錄因子：Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。但是，在這項新的研究中，這些研究人員利用一種表觀遺傳CRISPR技術激活僅一種轉錄因子---Sox2或者Oct4---的一個內源性基因拷貝，就將小鼠胚胎成纖維細胞轉換為ipsC。

加州大學舊金山分校幹細胞生物學家Sheng Ding和同事們使用了一種之前已發布的人工轉錄因子系統，該系統由一種經過修飾的沒有核酸酶活性的Cas9（dCas9）和蛋白結合結構域組成。當與嚮導RNA（gRNA）結合在一起時，dCas9靶向一個特定的基因組位點，並且招募一種經過修飾結合到這些特定結構域（即蛋白結合結構域）上的轉錄激活蛋白（transcriptional activator protein），因此也必需將這種轉錄激活蛋白導入到這些細胞中。這些研究人員通過轉染這種人工轉錄因子系統和18種gRNA（靶向與這4種傳統的轉錄因子和另外3種其他的多能性轉錄因子相關的一系列增強子和啟動子位點）到小鼠胚胎成纖維細胞中，成功地產生了ipsC。

Ding說，「我們最初的想法是內源性地同時激活這些基因。隨後，我們問道，這種方法存在的限制是什麼。如果我們僅激活一個基因或者說單個位點，那麼這就足夠了嗎？」

為了解答這個問題，Ding團隊每次逐個地移除gRNA。他們發現僅靶向Sox2的啟動子或Oct4的增強子和啟動子足以將小鼠胚胎成纖維細胞轉化為iPSC。他們還證實利用招募一種經過修飾的組蛋白乙醯轉移酶的dCas9激活Oct4也能夠導致小鼠胚胎成纖維細胞轉化為iPSC。這兩個發現表明操縱小鼠胚胎成纖維細胞的表觀基因組就能夠導致ipsC產生。

起初，Ding認為在一個位點激活單個基因來重編程細胞是不可能的，但是如今，他的團隊已針對它的工作方式提出了一個假設。他解釋道，「基因組並不是以線性的方式進行組裝。在三維結構下，許多[基因組]位點實際上是連接在一起的。因此，如果考慮這種三維結構，就能夠想像激活單個位點可能會讓它附近的很多位置也受到影響。」

這些研究人員計劃研究基因組相互作用可能在細胞重編程中發揮的作用。而且他們希望改進這種技術，以便利用它在體內重編程細胞，和產生不同的細胞類型用於細胞療法中。

美國喬治亞理工學院生物工程師James Dahlman（未參與這項研究）說，「在實際情形下，[細胞]受到自然微環境中的所有這些其他的信號通路的影響。如果你要開始使用相同的細胞類型，並讓它產生多能性，然後讓它再分化，從而獲得某種其他的你想要的細胞類型，那麼這種方法是否有用呢？我猜測答案是肯定的，但是存在的所有這些變化都是你必須理解和考慮的。」

加州大學伯克利分校細胞生物學家Dirk Hockemeyer（沒有參與這項研究）同意這一點，並解釋道，仍不清楚這個方法是否能夠應用於其他的應用上，比如將成纖維細胞轉化為心臟細胞。他說，「我們開發的工具越多越好。也許只有少數工具最終會在臨床中使用，但要知道這些工具是哪些是非常困難的，因此我們需要給予每種方法一個公平的機會。這是一個非常非常有前景的方法。」

參考資料：Peng Liu, Meng Chen, Yanxia Liu et al. CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency. Cell Stem Cell, Available online 18 January 2018, doi:10.1016/j.stem.2017.12.001

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