臨床病原菌分型及同源性分析方法學研究進展

本文原載於《國際流行病學傳染病學雜誌》2017年第3期

細菌分型和同源性分析方法的研究對於細菌的鑒定分型、進化演變、耐葯機制分析，流行病學研究，疫情監控和院內感控工作有重大意義。常用的細菌分型方法中分子分型在鑒定分型、分辨力、可重複性上更勝一籌。本文就以下幾種分子分型方法進行介紹：脈衝場凝膠電泳（PFGE），多位點序列分析（MLST），多位點可變數目串聯重複序列分析（ML-VA），規律成簇的間隔的短迴文重複序列（CRISPR），基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）等。多種分型方法聯合使用更有利於細菌的準確分型，明確到亞型；從分子水平了解細菌的演化過程，進行溯源；並有助於耐葯機制分析，指導臨床用藥，耐葯監測，在流行病學方面有重要意義。

一、PFGE

目前，PFGE被公認為細菌分型和同源性分析的"金標準"。PFGE工作原理：通過某些酶切位點的限制性內切酶酶切菌株DNA，大小不等的DNA分子片段在脈衝場中泳動，在泳動過程中需要改變其構型和調整泳動方向，而DNA分子用於重新調整泳動方向的時間與其相對分子質量大小密切相關，最後由於遷移的距離不同，被有效的分離。研究者要通過分析圖譜中條帶的差異明確菌株的來源及其親緣關係。PFGE應用於分離純化大小在10 kb~10 Mb的DNA片段[1]，它的優勢在於解析度高及可重複性強。

目前PFGE主要用於：（1）細菌性傳染性疾病/細菌性食源性疾病的病因溯源；（2）揭示菌株之間的遺傳關係，分析其耐葯機制；（3）有助於對暴發疫情及院內感染進行流行病學調查，明確感染來源及途徑，為細菌性疾病的預防監測與控制提供分子生物學證據；（4）為臨床診斷和治療提供依據，判斷感染是原菌株的複發還是再感染[2]。PulseNet資料庫是1996年由美國CDC建立的用於監測食源性疾病病原體的國家分子分型網路體系，該體系以PFGE技術為基礎，為各醫院病原學及流行病學數據資料交流提供了平台。PulseNet不僅可以用於鑒定各地散發案例之間的病原學關係，及時確認和處理大範圍內、呈散發特徵的暴發事件，也可以分析流行病的克隆播散、建立不同地區之間流行病暴發的流行關係以及溯源。

PFGE也存在很多不足：（1）肉眼判讀結果，使數據在不同實驗室之間的比較存在困難[3]，同時某些流行病學上無相關的菌屬間由於具備相同的內切酶位點而表現出相同的PFGE圖譜，所以很難從圖中得出確切的結論，需要結合流行病學資料及其他方面的資料進行綜合分析；（2）PFGE有時解析度過高，所以比較適合短時間內的流行病學調查，若時間過長，可能會將原本相關的菌株判定為流行病學無關菌株；（3）脈衝及電泳時間、電場的角度及強度、緩衝液濃度及溫度等均會影響PFGE解析度，細微的改變就會影響實驗結果，所以PFGE對實驗條件及操作者的技術及熟練程度的要求比較高。（4）耗時較長，一般整個實驗需要4 d左右，會錯過流行病學調查最佳時機，多用於回顧性研究。（5）實驗器材及試劑較貴，不適合大批量操作，且不適用於基層醫院。

二、MLST

MLST是基於核酸序列測定的細菌分型方法，它針對管家基因設計引物，對其進行PCR擴增和測序，得出每個菌株各個位點的等位基因數值，然後進行等位基因圖譜或序列類型鑒定，再根據等位基因圖譜使用配對差異矩陣等方法構建系統樹圖進行聚類分析。如今它已廣泛用於多種細菌的分型，最早用於腦膜炎奈瑟菌，現在在鮑曼不動桿菌、沙門菌等中的運用較為廣泛。它的優勢在於解析度高和可重複性好，獲得的結果可在不同實驗室間進行比較，通過互聯網數據系統進行共享。目前MLST所得結果的解析度可以和PFGE、AFLP技術相比較[4]。Donkor等[5]運用MLST、MLEE、PFGE、AFLP等方法對肺炎鏈球菌進行分型，報道稱MLST是肺炎鏈球菌分型最合適的方法。

但MLST也有其局限性：（1）管家基因進化緩慢及其高度保守性也導致MLST在某些病原菌分型應用中有一定的局限[5]。（2）MLST技術費用高，需特定儀器，使該技術局限於大型的流行病學研究和局部的食物中毒病暴發的溯源，一般實驗室較少用。

三、MLVA

MLVA是以PCR為基礎，根據待檢測菌株在基因組中不同獨立位點的可變串聯重複序列（VNTRs）重複次數的差異來進行基因分型，其的優點在於快速簡便、解析度高、重複性好。有研究表明MLVA與PFGE有較好的符合率[6]。MLVA能夠區分PFGE帶型相同的克隆株。有研究者將124株沙門菌菌株進行MLST、PFGE和MLVA分型，結果顯示應用MLVA方法來鑒別散發菌株的基因相似度和差異時解析度最高。MLVA可以應用於致病菌的快速分型和提高傳染病暴發調查的應急水平且只需基本的儀器設備，數據可在全球各實驗室對比。

同源性分析方法有單個分子標記技術，如PFGE、AFLP、隨機擴增多態性DNA分析（RAPD）等，和多個分子標記技術，如MLST、MLVA。其中MLST和MLVA以其解析度高、可重複性好和可比性強等優勢滿足了全球流行病學發展的要求，能實現數據交換和共享，成為新一代的分子分型工具。

四、CRISPR

CRISPR系統是近年發現的細菌針對噬菌體等外源DNA的獲得性免疫系統。在細菌進化過程中，CRISPR序列中間隔序列的插入和剔除使得CRISPR位點具有極高的多態性。利用適當的引物PCR擴增CRISPR位點，測序後可獲得CRISPR序列。通過分析CRISPR位點中間隔序列的組成和排列順序，可以用來對細菌進行分型。因此，CRISPR可作為細菌分型的理想位點，且目前已有研究者利用這一原理對細菌進行分型[7]。

CRISPR常應用於細菌的分型及溯源、細菌的疫苗接種、抗菌方法的評價和篩選研究[8]。目前在食源性細菌，尤其是沙門菌分型中應用最廣泛。由於CRISPR位點在沙門菌中具有高度多態性，通過比較菌株間的序列差異，能夠區分高度同源的血清型。目前，CRISPRS分型技術在沙門菌分型理論和技術方面正在不斷地完善，專門的CRISPRS網路資料庫（http：//crispr.u-psud.fr/crispr/）己經建立完成，CRISPR/Cas系統中的CRISPR簇已被廣泛證明可以簡便且精確的對菌株進行分型[9]。目前CRISPR已運用於艱難梭菌、大腸埃希菌、結核分桿桿菌等多種細菌的分型，也被拓展至菌株的溯源。

利用CRISPR不僅可以單獨對細菌進行分型，還可以與其他分型方法結合使用，如CRISPR與MLST相結合，生成新的方法CRISPR-MVLST。這個新的方法在細菌分型方面的區分度高於單獨的MLST及單獨的CRISPR。不管是單獨作為分型的位點還是結合其他分型方法，基於CRISPR位點的分型方法都具有較高的分辨力。在一項鼠傷寒沙門菌的研究中，研究人員運用了CRISPR-MVLST和PFGE兩種方法對菌株進行了分型，得出的結果相似[10]。證明了CRISPR-MV-LST對鼠傷寒沙門菌是很有效的分型方法；且CRISPR-MV-LST得出的結果可以用來補充和驗證由PFGE得出的分型結果。

五、MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS的檢測原理為在MALDI離子源部分，基質與樣本形成共晶體後，從激光中吸收能量使樣本解吸，基質與樣本間發生電荷轉移使得樣本分子電離；在TOF MS分析器部分，離子在電場作用下加速飛過飛行管道，飛行時間與離子的質荷比成正比，根據到達檢測器的飛行時間可測出質荷比，通過軟體處理就能得到病原菌特徵性的指紋圖譜[11]。MALDI-TOF MS主要通過檢測不同種屬微生物的保守蛋白峰進行病原菌的鑒定，通過檢測分析較獨特的蛋白峰在種內進一步分型[12]。MALDI-TOF MS技術主要用於病原微生物的鑒定、分型、毒力分析、耐葯檢測、耐葯機制及分子流行病學的研究等，被認為是一種新的快速可靠的細菌分型方法。

MALDI-TOF MS技術的優勢在於操作簡捷、自動化高、檢測迅速、準確靈敏、高通量、成本較低。同時有研究顯示其對細菌同源性分析的準確度可與PFGE相媲美[13]。這個方法相當實用，很符合院內感控及重大疫情快速鑒定病原菌的要求。現在常用的基於DNA及PCR擴增的方法雖然是被廣泛認可的，但它們價格昂貴，耗時且對技術人員要求高。MAL-DI-TOF MS技術是常規細菌分型的理想方法。MALDI-TOF MS的出現對於傳統方法鑒定中耗時的緩慢生長類病原菌，如分枝桿菌更具臨床意義，應用MALDI-TOF MS技術只需約1天的時間，成本較低，勞力消耗更低，性價比較高[14]。MAL-DI-TOF MS不但可快速鑒定純菌落，還可直接從臨床樣本中檢測微生物，比如陽性血培養瓶和尿液樣本。

MALDI-TOF MS的局限性：（1）某些病原微生物的遺傳背景相近，具有相似的指紋圖譜，會造成鑒定錯誤的情況出現；（2）細菌的培養條件和時間，蛋白提取方法步驟以及點樣的方法等均會造成質譜圖中各類參數的差異。細菌蛋白在表達過程中其丰度可能會受到這些的影響，因此會影響MALDI-TOF MS同源性分型的穩定性和精確性。

MALDI-TOF MS目前還未適用於所有細菌，目前研究比較透徹的是在大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等細菌中的應用。雖然不能取代分子生物學，但用MALDI-TOF進行流行亞型的鑒定可以加速實施感染控制措施以防止病原的傳播。

六、結語

除了以上方法外，還有很多基於PCR的DNA指紋圖譜技術分型方法被廣泛運用於臨床病原菌檢測中，如腸桿菌基因間重複共有序列（ERIC-PCR）、細菌基因組重複序列PCR技術（REP-PCR），擴增片段長度多態性分析（AFLP），隨機擴增多態性DNA分析（RAPD）等等。各種方法都有其應用範圍、優勢和局限性。細菌分型及同源性分析主要被用於研究實驗室的回顧性流行病學研究，或者是用於臨床實驗室常規檢測，快速得出結果，採取相關措施來控制流行克隆株的傳播[15]。所以，我們需要充分了解後根據實驗用途、要求及特點，同時結合自身實際情況選擇適當的方法，將所選方法的局限性規避，而把其優勢體現出來。

參考文獻（略）

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