綜述│豬肺異種移植的研究進展與發展方向
周明 鄧陽陽 戴一凡 蔡志明 牟麗莎
摘要
肺移植是治療終末期肺疾病的唯一有效方法，但一直面臨著嚴重的供體短缺問題。用豬肺替代人肺移植到人體內有望解決供體肺短缺的問題。但由於豬肺對多種損傷如組織灌注損傷、抗體依賴的補體損傷、適應性免疫反應以及凝血功能障礙造成的損傷等高度敏感，故而豬肺異種移植亦面臨著許多難題亟待解決。本文介紹了目前異種肺移植的國內外研究現狀，並歸納總結了異種肺移植的研究模型及其優缺點，著重論述了異種肺移植的損傷機制及可能的解決方案，並探討了異種肺移植的未來發展方向。
關鍵詞:異種移植肺移植豬免疫排斥凝血失調基因敲除；CRISP/Cas9技術
肺移植是治療終末期肺疾病的唯一有效方法，包括慢性阻塞性肺疾病、特發性肺纖維化、肺囊性纖維化、特發性肺動脈高壓、肺結節病、肺淋巴管平滑肌瘤病等。隨著手術技術的日漸成熟和免疫抑制的改進，肺移植在手術量、移植受者存活率等方面得到了長足的進步。根據國際心肺移植協會（International Society for Heart and Lung Transplantation，ISHLT）登記的數據，2014年度完成的肺移植手術已累計達51 440例，僅2013年度3 893例。然而，我國的肺移植全年僅149例，與我國龐大的人口基數不成比例[1]。
供體肺的嚴重短缺限制了肺移植的進一步發展，我國肺移植手術量有限亦充分說明大部分患者無供肺可用。再者，由於肺的體表面積比較大，在膨脹狀態時非常脆弱，使得肺在摘取和移植過程中易受損傷，導致肺移植的成功率在所有器官移植中相對較低。由於豬器官與人器官大小相近、來源不受限制，將豬肺替代人供肺移植給患者是一種很好的選擇，可有效緩解供體短缺問題，且通過基因修飾已有效降低豬供肺的免疫原性。目前，國內外頂尖科學家及其團隊正致力於豬肺異種移植的研究，並取得了一系列突破性的進展。
1
異種肺移植的研究模型
1.1
豬 - 非人靈長類異種肺移植模型
與臨床供肺受者最接近的動物模型是非人靈長類動物，如狒狒。通常情況下，異種移植模型是將豬的左單肺移植到狒狒的相應部位。根據ISHLT相關資料，當上述移植肺可維持受體生命至少3個月，且結果可重複實現時，該異種肺移植即可用於人體試驗[2]。目前，將豬肺移植到狒狒體內，其存活時間的最長記錄僅為5~8 d[3-4]。因此，儘管該模型是異種肺移植的經典模型，但由於該模型實驗花費大、有一定的倫理限制、受體存活時間短，故而不適合大規模的基礎性研究。
1.2
人血液離體灌注模型
利用新鮮的人血液在離體的生物反應器中對豬肺進行灌注，一方面恆溫血流通過蠕動泵流入肺臟，另一方面供風設備規律地對肺臟供氣以模擬呼吸，如圖 1所示。該模型能夠很好地重現豬肺異種移植到非人靈長類動物體內時的動力學、生理學以及免疫組織學等的變化過程，可用於觀察人類血液與豬血管內皮細胞接觸後的一系列變化，對異種移植後發生急性排斥反應的機製作進一步研究。除了簡單易行外，離體血液灌注模型的另一大優點是可進行獨立、平行的實驗研究，即利用該系統可以對豬的右肺和左肺進行獨立的通氣和灌注，從而為各種實驗提供了適合的實驗組（藥物處理組）和對照組（未處理組），可用於觀察干預措施的短期效應（6~8 h）[5]。因此，該系統可用於評估血液灌注、藥物處理以及移植前供體肺定向療法的效果。
1.3
人血 - 豬血管內皮細胞體外灌注模型
為了研究人的血液成份對豬血管內皮細胞的影響，科學家們開發出了模擬血液-內皮細胞相互作用的界面平台，如Bioflux系統（美國Fluxion Biosciences公司）。該系統利用人全血或血液中的某種成份灌注鋪有豬內皮細胞的微流體通道，通過可視化方法（如連續熒光成像）可實時觀察血液細胞粘附和血栓形成[6]，使得微血管功能失調以及血栓形成清晰可見。該模型最大的優點是簡單易行，但應用範圍相對局限。
2
異種肺移植損傷的機制及其解決方案
根據體外、離體、體內異種肺移植實驗結果，科學家們發現了多種異種肺移植的損傷機制，並制定了相應的保護供體豬肺不被排斥的策略。
2.1
先天性免疫
2.1.1 抗體與補體人類血液中存在著抗細菌表面抗原的抗體（如IgM和IgG），其中最重要的抗體能與豬細胞表面表達的α-1，3-半乳糖（αGal）殘基抗原結合，引發劇烈的補體激活和血栓形成，最終導致超急性排斥反應的發生和豬肺異種移植的失敗[7]。而αGal抗原表位是在α-1，3-半乳糖基轉移酶（α-1，3-galactosyltransferase, GGTA1）的作用下合成的，因此GGTA1基因敲除（α-1，3-galactosyltransferase gene-knockout，GTKO）小型豬能夠克服非人靈長類對供體器官的超急性排斥反應。然而，在離體人血液灌注肺模型中，αGal的缺乏只能輕微地延長豬肺的平均生存時間和降低補體沉積[8]。GTKO豬肺異種移植仍然很容易失敗，其主要原因可能與抗非Gal抗體有關[8]。豬血管內皮細胞上的N-羥乙醯神經氨酸（N-glycolylneuraminic acid，NeuGc）是另一個重要的異種抗體結合位點，由胞苷-磷酸-N-乙醯神經氨酸羥化酶（cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）合成。進一步將CMAH基因敲除（CMAH gene-knockout，CMAHKO）後，人血液對CMAHKO+GTKO細胞的排斥反應明顯減弱，CMAHKO+GTKO豬的肺功能維持和器官存活時間可以進一步延長[9]。另外，將人補體調節蛋白（human complement regulatory proteins，hCPRPs）如CD46和CD55，克隆到GTKO豬體內使其過表達，可降低補體的激活[10]。因此，通過敲除異種抗原基因（如GGTA1、CMAH）、克隆人源化基因等方法培育的基因修飾豬可能會推進豬肺異種移植的臨床應用。
2.1.2 豬肺巨噬細胞和巨噬細胞受體肺巨噬細胞主要存在於血管內和肺泡內，是炎症細胞因子的主要來源，可放大前凝血因子信號，加劇排斥反應[11]。移植前，應用脂質體-氯磷酸鹽可清除豬肺巨噬細胞，抑制血栓的形成和炎症通路的激活，延長異種肺移植物功能的維持時間[12]。另外，由於信號調節蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα）與CD47分子之間的相互作用會誘導物種間的不相容性，促使豬巨噬細胞吞噬人血細胞和血小板[13]，因此，將人SIRPα基因克隆到豬巨噬細胞上可避免豬巨噬細胞對人血細胞和血小板的吞噬作用。同樣，當人巨噬細胞上的SIRPα識別了豬細胞上的人CD47，吞噬作用同樣也會終止[13]。因此，豬的CD47人源化修飾能夠抑制人巨噬細胞的激活，減弱豬肺異種移植的排斥反應。
2.1.3 自然殺傷細胞人自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）在異種肺移植排斥反應中起著重要的作用。在離體人血液灌注模型中NK細胞可侵襲到豬肺中，而在體外它們可直接或間接通過抗體依賴的毒性作用殺死豬血管內皮細胞[14]。科學家對GTKO+hCD46克隆豬進行了人白細胞抗原（HLA）-E基因修飾，與GTKO+hCD46克隆豬相比，在離體人血液灌注模型中，HLA-E基因修飾能明顯減輕肺損傷。另外，特異性高表達於母胎界面絨毛外滋養細胞中的HLA-G對異種移植的豬肺有一定的保護作用，因為在豬內皮細胞中表達HLA-G分子可直接抑制人NK細胞對豬內皮細胞的異源殺傷作用，其抑制作用可被抗CD94抗體阻斷[15]。
2.1.4 凝血功能豬血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF)不同於人vWF，豬vWF不需要剪切就能結合到人血小板膜糖蛋白（platelet membrane glycoprotein Ⅰb，GPⅠb）上，誘導血小板的激活和聚集[16]。為克服由豬vWF造成的高凝狀態，獲取器官前在豬體內注射去氨加壓素以耗盡豬的vWF，或在受體體內注射GPⅠb、GPⅡb或GPⅢa拮抗劑以減弱血小板的激活和螯合[17]。
組織因子途徑抑製劑（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）是凝血因子Ⅹa的直接抑製劑，異種肺移植後，豬TFPI和人凝血因子Ⅹa的不相容可能會導至凝血功能調節障礙和血栓形成。人TFPI的表達有利於減少豬組織因子誘導的血栓形成[18]。但是，到目前為止，全身性高表達人TFPI的豬不能成活，因此我們需要應用一定的轉基因技術使人TFPI條件性地或組織特異性地表達在豬的內皮細胞上[19]。
豬血管內皮細胞蛋白C（protein C，PC）受體位於血管內皮細胞上的凝血酶調節蛋白（thrombomodulin，TM），是凝血酶的受體，與凝血酶結合後，一方面能夠抑制凝血酶對血小板、凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活化作用，另一方面能夠使凝血酶轉變為PC的激活物，啟動PC抗凝途徑。豬TM雖然能夠與人凝血酶相結合併抑制其促凝血活性，卻不足以激活人PC抗凝途徑，從而導致活化的蛋白C水平（activated protein C，aPC）降低，而aPC是一個強有力的抗凝和抗炎分子[20]。科學家培育出的表達人TM和（或）內皮細胞蛋白C受體（endothelial protein C receptor，EPCR）的轉基因豬，已證明這些基因修飾能明顯降低凝血功能障礙的發生率[19]。
2.2
適應性免疫
眾所周知，適應性免疫在異種移植排斥反應中扮演著重要角色。最小化適應性T細胞免疫反應可減少外源性免疫抑製劑的用量。細胞毒T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）是T細胞活化共刺激信號通路中的重要分子，豬肺CTLA4-Ig的表達可抑制T細胞的活性，但卻容易使機體遭受機會性感染[21]。因此，注射外源性CTLA4-Ig、條件性或者組織特異性表達CTLA4-Ig可能是抑制適應性T細胞免疫反應更為安全的選擇[19]。
2.3
炎症反應
在異種肺移植中，炎症介質的產生環節是重要的治療靶點。人CD39的表達有利於機體的血栓調節作用和抗炎作用，可降低炎症細胞和促炎因子的水平[22]，最終減少豬細胞的凋亡[17]。藥物干預措施對肺炎具有保護作用，在離體實驗中，血栓素合成酶抑製劑（N-苄基咪唑）和組胺受體封閉劑（苯海拉明、法莫替丁）能顯著提高肺功能和延長存活時間[19]。另外，在豬體內表達抗凋亡分子如Bcl、腫瘤壞死因子（TNF）-α受體、TNF相關的凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）和淋巴細胞特異性接頭蛋白（lymphocyte specific adapter protein，Lnk），對豬肺也有一定的保護作用[17]。
3
異種肺移植的未來發展方向
3.1
豬的多基因修飾
據報道，移植到非人靈長類動物（狒狒）身上的豬腎存活並發揮功能的時間已達到136 d[23]。據2016年國際移植協會會議（International Congress of the Transplantation Society，TTS）報道，異種移植豬腎功能性存活時間已超過270 d。將αGal抗原敲除、過表達人補體調節蛋白CD46以及人凝血酶調節蛋白後培育出的基因修飾豬（GTKO+hCD46+hTM）的心臟移植到狒狒身上，結合抗CD40抗體，異種移植的心臟存活時間可達945 d[24]。與其它實體器官移植相比，異種肺移植的難度更大。最近，Natalia Kubicki研究組將GTKO豬的肺移植給非人靈長類，移植豬肺維持受體生命超過了24 h，在實驗結束時肺功能與組織學檢查結果顯示正常；而在原位肺移植實驗中，供體存活時間超過了8 d[4]。如上文所述，與肺保護相關的候選靶基因眾多，隨著基因編輯技術（如CRISP/Cas9）的迅猛發展，在不久的將來，很可能出現集多種基因修飾於一體的「萬能」豬。異種移植豬肺的功能維持時間與器官存活時間有望進一步延長，最終達到臨床應用的要求。
3.2
囊胚互補技術在人源化器官改造上的作用
在豬體內重構人源化器官，既可重構出結構與功能完善的器官，又可避免跨物種移植導致的排斥問題，囊胚互補技術應運而生。採用CRISP/Cas9基因敲除技術使豬體內某個器官「發育缺陷」，再將誘導型多能幹細胞注射到囊胚期的豬胚胎中，使其彌補特定器官的「發育缺陷」，最終重構出幾乎完整的人源化器官[25]。2013年Nakauchi研究組通過囊胚互補技術成功生成了豬胰腺，表明這種方法可在豬體內實現[26]。儘管科學家們找到了豬肺發育相關的關鍵基因，但目前仍然沒有成功培育出肺發育缺陷豬的相關報道。儘管這項技術的可行性尚不明確，但在豬體內重構人源化器官仍然極具研究前景。
作者單位：510275 廣州，中山大學（周明、牟麗莎）；深圳市第二人民醫院（周明、鄧陽陽、蔡志明、牟麗莎）；南京醫科大學（戴一凡）
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