細胞膜蛋白超靈敏定量新技術

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定位於生物膜的蛋白質分子是聯繫「細胞王國」與胞外環境的一類極為關鍵的生物功能分子，在物質運輸、細胞通訊、能量代謝、胞內信號轉導等細胞過程中扮演著重要的角色，因此對膜蛋白定量分析的重要性不言而喻。然而，由於膜蛋白通常具有疏水結構域、相互作用的異質結，而且存在於複雜的周邊環境，因此，對膜蛋白進行定量往往需要繁瑣而複雜的前處理，如膜蛋白的分離、提純等，從而給日常的科學研究及實際應用增加了很多工作量。此外，對於低丰度膜蛋白的定量分析，一些常用的分析方法往往在靈敏度方面不能滿足要求。

近日，南京大學的李根喜教授課題組轉變思路，省去了常規的分離、純化步驟，提出一種細胞膜蛋白定量的新技術，即直接利用簡便的基於核酸擴增的原位分析方法對膜蛋白進行定量，而且實現了極高的靈敏度。該技術是一種基於原位DNA滾環擴增為模板的信號放大策略（in siturolling cycling replication-templated amplification,isRTA）（如圖1），以「原位標記-滾環擴增-循環再放大」的方式進行，第一輪擴增的產物為第二輪信號放大提供模板，實現了兩輪級聯的核酸原位等溫擴增反應，由此被標記膜蛋白的定量信號得以顯著增強，細胞膜蛋白得以超靈敏量化。

圖1.isRTA策略：核酸探針及引物（AP）的標記；DNA滾環擴增（RCA）；基於滾環擴增的二次信號放大（RTA）

李根喜教授等人進一步利用該技術，選取細胞上的一組膜蛋白進行定量分析，以對不同類型的細胞進行區分和識別。在該工作中，他們將一系列腫瘤相關的標誌物（MUC1、EpCAM和HER2）進行量化（如圖2），結果表明這些標誌物在不同類型的乳腺癌細胞中分布，從而實現了乳腺癌細胞亞群的精確分型。

圖2. 基於isRTA的多種細胞膜蛋白定量及「色域法」的細胞分型。選取的一組代表性膜蛋白（MUC1、EpCAM和HER2）被定量，隨後進行歸一化及RGB編碼，由此每一種細胞就可以在色域圖中找到其定置，實現細胞分型。

該技術的優勢主要包括：生物相容性和良好的等溫反應性；將膜蛋白的測定轉化成對核酸的測定，且由核酸組裝、切割循環放大獲得很強的信號放大能力。兩者結合為膜蛋白的定量分析提供了新的思路，降低了實驗的複雜性，並可得到超高的靈敏度。這一成果近期發表在Analytical Chemistry上，文章的第一作者是博士研究生高濤（現於上海大學從事博士後研究），研究工作得到了國家自然科學基金重點項目的支持。

該論文作者為：Tao Gao, Bei Wang, Liu Shi, Xiaoli Zhu, Yang Xiang, Jun-ichi Anzai, Genxi Li

Ultrasensitive Quantitation of Plasma Membrane ProteinsviaisRTA

Anal. Chem.,2017, DOI: 10.1021/acs.analchem.7b02025

李根喜教授簡介

李根喜，南京大學教授，博士生導師，國家傑出青年基金獲得者；1984～1994年在南京大學化學系高分子化學、分析化學專業學習，分別獲學士、碩士和博士學位；1994年6月在該校生化系從事博士後研究，1996年5月出站並留在生化系任教，1996～2000年為副教授，2001年為教授、博士生導師；其中，1998～2000年分別在德國慕尼黑大學生物系、日本東北大學藥學部、美國哈佛大學醫學院生化與分子藥學系從事訪問學者工作，1999年1月～2010年5月任南京大學生化系系主任，2006年任上海大學兼職教授，2008年11月～2011年10月任上海大學生命科學學院院長；主要從事生物分子識別與感測及定量分析方法的研究；已發表SCI論文230餘篇，他引6500餘次，參編Encyclopedia of Sensors等叢書，並編寫了Electrochemical Analysis of Proteins and Cells等專著；先後擔任中國生物化學與分子生物學會理事會理事、蛋白質專業委員會副秘書長、副主任兼秘書長、中國生物物理學會理事會理事、中國儀器儀錶學會化學感測器專業委員會委員。

http://www.x-mol.com/university/faculty/48460

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