眼乾細胞與再生醫學之視網膜的發生髮育

來源：《現代幹細胞與再生醫學》龐希寧 徐國彤 付小兵

編輯：中科政興

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眼睛是我們身體中最重要的感覺器官,組織結構精細而複雜,來自不同胚層的細胞巧妙而準確地彼此連接,從而能夠完成從外界獲得視覺信息的功能。眼球本身這個直徑約22mm的近球形器官的結構常被形象地類比為照相機。堅韌的纖維組織維持著眼球的結構,角膜、房水、晶狀體和玻璃體構成了功能上的屈光傳導系統,而視網膜構成的感光成像系統至少在成像原理上類似傳統照相機底片或數碼照相機中由CCD/CMOS半導體器件構成的影像感測器。屈光傳導系統從前到後保持透明,因為這些結構排列有序,沒有血管,沒有色素,除角膜外基本都沒有神經支配,並且整個系統很少有細胞,主要器官晶狀體更是除上皮細胞和赤道區的部分細胞外,絕大部分晶體纖維甚至沒有細胞核(圖6-1)。相比之下,視網膜作為感光組織,其組織幹細胞在視網膜損傷和(或)疾病修復中的作用應該被有效激活和利用,而在干預目前難治的嚴重視網膜退行性病變時,基於幹細胞的視網膜再生治療更具有特別重要的意義

幹細胞,由於其具有自我更新和多向分化的潛能,可以分化成各種組織乃至發育或成熟過程中各階段的細胞,為那些目前難治的重要視網膜疾病的有效干預提供了新的思路和工具。但不同類型的幹細胞,具有不同的細胞生物學特性,包括細胞行為、分化傾向、旁分泌功能等。這為我們治療視網膜疾病提供了多種選擇但也給我們提出了如何研發及選擇合適的供體細胞的挑戰。面對這樣的挑戰,我們不僅需要了解有關視網膜疾病的病理基礎和分子機制,也需要更多地認識視網膜組織的發生髮育過程。

以再生醫學為基礎的角膜修復與再生已獲得重要進展,包括生物材料和基於幹細胞的治療方法,或者兩者的相互結合,有望部分或全部代替患病的角膜。角膜原位強化治療方法可以在不進行移植的情況下,修復病變角膜眼球壁組織包括三層:外層為鞏膜,是堅韌的結締組織外衣,並在眼前表面延續成透明的角膜;中層葡萄膜是含有大量色素的血管性結構,為眼球提供養分;內層視網膜層,由較薄的視網膜色素上皮細胞層和較厚的神經視網膜層構成,神經視網膜中視細胞將光子轉換成電信號,通過視神經傳遞給大腦。間血管層在眼前部增厚,形成環形肌組織,稱為睫狀體。血管層進一步向前延伸形成有瞳孔的虹膜。

視網膜的結構

視網膜主要由視網膜色素上皮層、光感受器細胞層、外界膜、外核層、外叢狀層、內核層、內叢狀層、神經節細胞層、神經纖維層和內界膜組成。簡單概括:視網膜位於眼球壁內層,前起鋸齒緣,後止於視盤。構成視網膜內層的神經視網膜和外層的色素上皮層分別來源於胚胎早期視杯的內、外層。視網膜主要由七種(光感受器細胞為一類)細胞組成四層細胞結構,組織學上分為十層。根據發育來源和細胞成分,視網膜分為兩大層:外面的視網膜色素上皮層和內側的神經視網膜。前者來源於視杯靠近視柄沒有發生內陷的部分,後者則來源於前端內陷的部分。兩層之間是一個潛在的間隙,即視網膜下腔,是供體細胞移植時經常選擇的部位。移植前,通常先人為做一個局部視網膜脫離。注射細胞或基因後,神經視網膜一般會很快複位。

視網膜再生的基礎

視網膜組織結構的特點,在為幹細胞治療其病變提供了需要的目的細胞（治療用的供體細胞）量較少、病變組織的結構特點有利於供體細胞準確到位、病變組織的微環境特點有利於供體細胞存活、病變組織器官的功能檢查簡便，指標明確、幹細胞治療後出現腫瘤等問題可早期發現並有辦法干預、局部治療時對全身的影響較少等有利條件的同時,也給治療視網膜疾病帶來了特有的困難,如RPE細胞的極性的控制。在其他一些組織,細胞直接注射到病變部位可能都有效果。但RPE的功能只有在其按應有的極性排列才能發揮支持光感受器細胞的作用。目前採取的對策一是在體外把誘導分化來的RPE細胞在介質上生長並保持一致的極性排列,然後剪取一小塊進行移植。介質通常採用可降解可吸收的材料,或者在移植前去掉介質,僅植入細胞植片。另一對策是移植前體細胞,使供體細胞在微環境中多種因子的作用下,在分化成RPE細胞的過程中自己按應有的極性排列整齊。當然,不排除一種可能,RPE細胞自己能根據在視網膜下腔中的位置調整自身的極性。但這種可能還需要有實驗證實。目前尚未面對但可以想像的另一弊端,是再生細胞存活下來、分化為光感受器細胞並發揮功能時,治療眼影像與對側眼影像的一致性問題。我們視物用兩隻眼睛,給了我們很好的空間立體感。實現這一功能的一個重要基礎,是兩眼視網膜上注視同一點的視細胞間有精密的定位和準確的對應。移植的供體細胞即使存活下來,與下一級神經元(雙極細胞)的突觸連接未必與原來被替代的細胞一樣,導致治療眼單獨視物時尚好,但與對側眼的影像不一致,引起大腦視中樞混亂。在幹細胞分化為RPE細胞時,應該不會發生這種情形。

視網膜幹細胞

與機體其他組織類似,視網膜也有其組織幹細胞,作為組織損傷或疾病後的修復。不過,視網膜幹細胞的修復能力可能不夠強,很多視網膜疾病或損傷後難以靠自身幹細胞完成修復。而且,目前對大多數生物視網膜幹細胞的數量、位置、特徵、調控機制等所知尚少,對如何激活視網膜中靜息狀態的組織幹細胞或誘導視網膜其他細胞轉分化獲得乾性更是新的挑戰。總之,視網膜幹細胞研究還剛起步,有大量寶藏有待開發。

組織細胞在不斷分化的過程中發生死亡。為保證機體中各組織器官能正常執行其功能,機體的很多組織中保留有一些具有自我更新和分化潛能的幹細胞,屬於成體幹細胞。在機體細胞死亡或者受損時,組織中的幹細胞會被激活而誘發向受損傷細胞的分化,修復和再生受損的器官,替代受損傷細胞以維持細胞、組織或器官的功能。視網膜幹細胞屬於成體幹細胞中的一種。

利用幹細胞再生修復視網膜

利用自體眼內幹細胞誘導分化或利用眼組織其他細胞轉分化這兩種策略實現的臨床視網膜再生治療即使研發成功,也可能受到應用上的限制。一是哺乳類視網膜再生修復機制比非哺乳類極大地減弱,二是很多視網膜疾病會同時損傷視網膜幹細胞或前體細胞以及其他細胞。遺傳性疾病更是使視網膜其他細胞也因與損傷細胞帶有同樣的基因組而無法分化出健康的細胞進行功能替代。因此,很多研究都聚焦在如何利用異體的細胞進行定向分化產生治療用的供體細胞,或者PSC技術對自體其他組織細胞進行定向誘導分化和基因矯正後進行治療。在幹細胞技術興起之前,人們已經嘗試用異體供體細胞移植進行替代治療了。使用的細胞主要是取自流產胎兒或者眼庫捐贈眼的視網膜光感受器細胞或者是RPE細胞。這類細胞移植治療不僅在動物實驗中取得成功,而且在不同的視網膜變性病例中移植胎兒視網膜前體細胞的1期臨床試驗也獲得一定程度的成功。但由於獲得合適的供體細胞非常困難,特別是從流產胎兒獲取,還存在倫理上的爭議和阻礙。因此,1998年人胚胎幹細胞(hESC)建系成功後,人們的努力開始轉向用ESC定向誘導分化獲得視網膜光感受器細胞或RPE等供體細胞。近年來,利用iPSC及成體幹細胞進行視網膜再生治療的嘗試研究也獲得進展,使獲得治療性供體細胞的途徑越來越多。主要包括胚胎幹細胞來源的視網膜細胞、誘導多能幹細胞來源的視網膜細胞、成體幹細胞來源的視網膜細胞。

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