lncRNA鑒定專題-樣本和測序要求

lncRNA測序採用 Illumina HiSeq 平台進行測序，針對有參考基因組樣本開展準確的 lncRNA 鑒定和 lncRNA 靶基因預測，同時提供針對測序數據中 mRNA 的分析，結果更全面，廣泛應用於醫學、農學研究領域。技術路線

樣本要求

lncRNA鑒定1.文件準備下載參考基因組及gtf文件，或者自己組裝的也可以使用準備cDNA或mRNA序列，如有lncRNA序列也可直接使用2.比對基因組軟體：RWA，Tophat,Hisat2每個樣本的測序數據mapping到基因組3.轉錄本組裝這裡可以選擇cufflink或者Stringtie，重點推薦Stringtie。Stringtie能夠拼接處更完整、更準確的基因，並且Stringtie採用拼接和定量同步運行，相對於其他方法，其定量結果更準確根據評測，對於從人類血液中獲得的reads，Stringtie正確組裝了10,990個轉錄本，而Cufflinks只組裝了7,187個。對於模擬的數據集，Stringtie正確組裝了7,559個轉錄本，比Cufflinks的6,310個提高了20%。此外，它的運行速度也比其他組裝軟體更快4.轉錄本合併方法：可使用cuffmerge，Stringtie merge,TACO三個軟體合併所有gtf文件。而當樣本數目急劇增加時，合併得到的轉錄本數目會增加，假陽性率也會隨之升高。這裡推薦NATmethods最新發表的軟體TACO來進行大樣本gtf文件的整合說明：當樣本較少的時候，三種軟體整合出的基因亞型相差不大。如果樣本數目大於50時，cuffmerge和Stringtie在固定的區域 會整合出長的假的嵌合體和較多的亞型，而TACO結果則保持一致的基因亞型5.lncRNA過濾a.可選步驟根據blast結果過濾與已知lncRNA大於0.9相似的轉錄本Nr,Pfam,Dfam,animal/plant nc database都可以進行blast比對來進一步過濾ORF長度預測，一般過濾大於50AA的轉錄本b.軟體特有步驟Cufflink結果中可選擇class-code為「i，j，u，o」的轉錄本作為保留Stringtie和TACO結果根據位置關係過濾掉與已知轉錄本位置和方向重合的轉錄本，保留反義轉錄本c.必備步驟過濾exon小於2，長度小於200bp，FPKM小於1的轉錄本分別用CPC，CNCI，PfamScan三個軟體來對進行編碼潛能預測，保留非編碼轉錄本d.三大主流網站CNC：https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI鑒定標準：CPC_threshold = 0，大於0的轉錄本為mRNA，小於0的為lncRNA；CNCI_threshold = 0，大於0的轉錄本為mRNA，小於0的為lncRNA；PfamScan：比對上Pfam蛋白資料庫的為mRNA，沒有比對上的為lncRNA；注意：cpc和PfamScan需要先建立蛋白參考資料庫，cpc可以下載Uniprot/swissprot蛋白序列；PfamScan輸入的是蛋白序列，可以由cpc的預測結果得出。

參考資料基因幫：lncRNA研究思路與方法

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