質譜成像技術的完美解釋！

現代生物學研究已經不再停留在僅從組織中識別一種特殊的化學成分，或者蛋白成分上了，我們需要精確的了解這些物質是如何分布，如何構成的，解答這些問題需要更進一步的實驗技術，比如，免疫組化或免疫熒光檢測方法，但是這些技術需要特殊的抗體，而且效率低，偏差大。

因此，研究人員將目光轉向了質譜技術上，以質譜為基礎的成像方法不局限於特異的一種或者幾種蛋白質分子，可在組織切片中找到每一種蛋白質分子，並提供這些蛋白質分子在組織中的空間分布的精確信息，而事先無需知道所檢測蛋白的信息，不需要對待測物進行標記，分析物可以其最初的形態被檢測，同時可對這些蛋白質分子含量進行相對定量，適用於研究生物分子的反應。

質譜成像（Imaging Mass Spectrometry, IMS）這種最新原位分析技術主要是利用質譜直接掃描生物樣品，分析分子在細胞或組織中的「結構、空間與時間分布」信息。其基本流程（以質譜分析生物組織標記物為例）見下：

簡單而言，質譜成像技術就是藉助於質譜的方法，再配套上專門的質譜成像軟體控制下，使用一台通過測定質荷比來分析生物分子的標準分子量的質譜儀來完成的。但是隨著這項技術的不斷發展，也陸續出現了許多針對各種問題的新技術。

最早的質譜成像技術是基質輔助激光解吸電離（MALDI，matrix assisted laser desorption ionization）質譜分子成像技術，由范德堡大學（Vanderbilt University）的Richard Caprioli等在1997年提出，他們通過將MALDI質譜離子掃描技術與專業圖像處理軟體結合，直接分析生物組織切片，產生任意指定質荷比（m/z）化合物的二維離子密度圖，對組織中化合物的組成、相對丰度及分布情況進行高通量、全面、快速的分析，可通過所獲得的潛在的生物標誌物的空間分布以及目標組織中候選藥物的分布信息，來進行生物標誌物的發現和化合物的監控。

正如數字圖像包括三個通道：紅，綠，藍一樣（單個亮度定義了每個像素的顏色），質譜成像也包含了數以千計的通道，每一個對應於一個特殊的光譜峰值，「你可以通過質譜方法從這些像素中獲得任何信號，然後調整圖像中所需分子像素的相對亮度，最後，得到一張分子特異性的成像圖。」

這種方法可用於小分子代謝物，藥物化合物，脂質和蛋白，而且,質譜成像能相對快速的利用許多分子通道，完全無需特殊抗體,下面列出五種先進的質譜成像方法。

I.挑戰高分子量蛋白——MALDI質譜分子成像技術

在對組織或生物體進行成像，分析小分子構成的時候，有一個「攔路虎」總是阻礙實驗的進程，那就是多肽，這些多肽體積十分大，要想對它們進行分子成像幾乎是不可能的，比如，想要研究腫瘤邊緣的分子微環境，如果直接成像是不可能獲得清晰圖像的。

來自范德堡大學的質譜方法專家Richard Caprioli博士因此發明了基質輔助激光解吸電離（MALDI）質譜分子成像技術，這項技術不局限於特異的一種或者幾種蛋白質分子，它可在組織切片中找到每一種蛋白質分子，並提供這些蛋白質分子在組織中的空間分布的精確信息，而事先無需知道所檢測蛋白的信息。同時，可對這些蛋白質分子含量進行相對定量。

MALDI質譜分子成像是在專門的質譜成像軟體控制下，使用一台通過測定質荷比來分析生物分子的標準分子量的質譜儀來完成的。被用來研究的組織首先經過冰凍切片來獲得極薄的組織片，接著用基質封閉組織切片並將切片置入質譜儀的靶上。通過計算機屏幕觀察樣品，利用MALDI系統的質譜成像軟體，選擇擬成像部分，首先定義圖像的尺寸，根據尺寸大小將圖像均分為若干點組成的二維點陣，來確定激光點轟擊的間距。激光束通過這個光柵圖案照射到靶盤上的組織切片，軟體控制開始採集質譜數據，在質譜儀中，激光束對組織切片進行連續的掃描，組織樣品在激光束的激發下釋放出的分子被質譜儀所鑒定從而獲得樣品上每個點的質荷比（m/z）信息，然後將各個點的分子量信息轉化為照片上的像素點。在每個點上，所有質譜數據經平均化處理獲得一幅代表該區域內化合物分布情況的完整質譜圖。儀器逐步採集組織切片的質譜數據，最後得到具有空間信息的整套組織切片的質譜數據。這樣就可以完成對組織樣品的「分子成像」。設定m/z的範圍，即可確定該組織區域所含生物分子的種類，並選定峰高或者峰面積來代表生物分子的相對丰度。圖像中的彩色斑點代表化合物的定位，每個斑點顏色的深淺與激光在每一個點或像素上檢測到的信號大小相關。

通過增加單位面積上轟擊的激光點數量和像素，研究人員可以獲得更多的樣品信息，例如，採用4000像素比200像素能夠得到更好的樣品圖像。質譜分子成像技術是一種半定量或相對定量技術，圖像上顏色深的部分表明有更多的生物分子聚集在組織的這個部分，然而，不可能據此確定生物分子在組織的不同部位的實際絕對含量。選擇組織圖像上的任意一個斑點，圖像都能夠給出一個質譜譜圖或者離子譜圖，代表在組織的該部位存在這種生物分子，然後,與做指紋圖譜類似，像做指紋圖譜那樣，將樣品的離子譜圖與已知標準品進行對照，分析差異，從而進行生物標誌物的發現和藥物作用的監控。

Ⅱ.無需樣品處理實時成像——電噴霧電離技術

一般質譜成像方法由於體積龐大，重量重，需要冗長的樣品準備階段，因此，並不適用於即時成像（bed side applications），比如，要幫助外科醫生進行實時的腫瘤邊界成像監控，那麼就要尋找新的方法了。

一種稱為電噴霧電離技術（desorption electrospray ionization，DESI）的MS成像技術解決了這個問題。DESI技術於2004年首次提出，由於這一方法具有樣品無需前處理就可以在常壓條件下，從各種載物表面直接分析固相或凝固相樣品等優勢而得到了迅速的發展。

這種方法的原理是帶電液滴蒸發，液滴變小，液滴表面相斥的靜電荷密度增大。當液滴蒸發到某一程度，液滴表面的庫侖斥力使液滴爆炸。產生的小帶電液滴繼續此過程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發，就可獲得自由徘徊的質子化和去質子化的蛋白分子DESI與另外一種離子源：SIMS（二次離子質譜）有些相似，只是前者能在大氣壓下遊離化，發明這項技術的普渡大學Cooks博士認為DESI方法其實就是一種抽取方法，即利用快速帶電可溶微粒（比如，水或者乙腈acetonitrile）進行離子化，然後衝擊樣品，獲得分析物的方法。

DESI系列產品最大的優勢就在於無需樣品處理，一般質譜和高效液相色譜分析，樣品必須經過特殊的分離流程才能夠進行分析檢測，使得一次樣品檢測常常需要約一個小時,而DESI系列產品可將固體樣品直接送入質譜,溶液被噴射到檢測表面,促使樣品離子均勻分布。採用這一手段的質譜分離過程，只需3分鐘左右即可完成。

Ⅲ.活體成像——APIR MALDI/LAESI技術

了解細胞的內部成分是理解健康細胞不同於病變細胞的關鍵，但是，直到目前為止，唯一的方法是觀察單個細胞的內部，然後將其從動物或植物中移除，或者改變細胞的生存環境。但是這麼做的話，會使細胞發生變化。科學家還不是很清楚一個細胞在病變時與健康細胞的差別，或者當它們從一個環境移到另一個環境中產生的變化。

來自華盛頓大學Akos Vertes教授希望能從另外一個方面來進行活細胞分析，在他的一項關於活葉樣品中初級和次級代謝產物分布的研究中，研究人員發現葉片中積累基質很厚，常導致光譜末端低分子量部分模糊，而且基質輔助激光解析電離（MALDI）質譜分析需要在真空中進行，但是，活體樣本在真空中無法存活。

實際上，MALDI質譜分析的原理是將分析物分散在基質分子中並形成晶體，當用激光照射晶體時，由於，基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積並迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使基質和分析物膨脹並進入氣相。而生物樣品也可以直接吸收能量的，比如，2.94mm波長的光能激活水中氫氧鍵。

因此，Vertes等人想到複合兩種技術來解決這一問題。首先他們利用大氣壓紅外線（an atmosphericpressure infrared，APIR）MALDI激光直接激活組織中的水分，使樣品氣化，就像是組織表面發生了細胞大小的核爆炸，從而獲得了離子化微粒，進入質譜中進行分析。但是並不是所有的氣化微粒都帶電，大部分其實是不帶電的，會被APIR MALDI遺漏。

為了捕捉這些中性粒子，Vertes等人採用了第二種方法：

LAESI(laser ablation electrospray ionization，激光燒蝕電噴霧電離)，這種方法能捕捉大量帶電微滴的微粒，然後重新電離化。通過對整個樣品進行處理，複合這兩種方法，就能覆蓋更多的分子，分析質量更高。

與一般質譜成像過程不同，Verte的方法還在成像中增加了高度，從而實現了3D代謝物成像。這項技術的解析度是直徑10mm，高度30mm，這與生物天然的立體像素相吻合，這樣科學家們就可以獲得天然構像。

Ⅳ.3D成像——二次離子質譜技術

質譜成像技術能將基質輔助激光解吸電離質譜的離子掃描與圖像重建技術結合，直接分析生物組織切片，產生任意質荷比(m/z)化合物的二維或三維分布圖。其中三維成像圖是由獲得的質譜數據，通過質譜數據分析處理軟體自動標峰，並生成該切片的全部峰值列表文件，然後成像軟體讀取峰值列表文件，給出每個質荷比在全部質譜圖中的命中次數，再根據峰值列表文件對應的點陣坐標繪出該峰的分布圖。

但是，一般的質譜成像技術不能對一些攜帶大分子碎片的化學成分進行成像，來自賓夕法尼亞州州立大學的NicholasWinograd教授改進了一種稱為二次離子質譜（SIMS，secondary ion mass spectrometry）的方法，可以對樣品進行完整掃描，三維成像。

SIMS早在用於生物學研究之前就已經應用廣泛了，比如，分析集成電路（integratedcircuits）中的化學成分，這種質譜技術是表面分析的有利工具，能檢測出微小區域內的微量成分，具有能進行雜質深度剖析和各種元素在微區範圍內同位素丰度比的測量能力。

這種技術具有幾個優點：

速度快（－10,000 spectra per second），亞細胞構造解析度（－100nm），以及不需要基質。但是另外一方面，不同於MALDI方法，SIMS方面不是一種「軟」技術，這種方法只能對小分子成像，因此常常需要進行粉碎。

Winograd教授改進了這一方法，他利用了一種新型SIMS光束（carbon-60磁性球），這種新光束比傳統的SIMS光束對物體的化學損傷更小。C60同時撞擊樣品表面，類似於「一陣爆炸」，這樣重複的轟擊使得研究人員能深入樣品，進行三維分子成像，Winograd教授稱這個過程是「分子深度成像」（molecular depth profiling）。

C60的能量與其它的離子束相當，卻不到達樣品表面以下，這樣樣品可以連續地被逐層剝離，研究人員就可以得到縱面圖形，最終獲得三維的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液將硅的薄片包裹起來並進行SIMS實驗，隨著薄膜逐漸被C60剝蝕，可以獲得糖和肽的穩態信號。最終，薄膜完全剝離後就可以獲得硅的信號。如果用其它的射線或原子離子代替C60，粒子束會快速穿過肽膜而無法提供有關生物分子的信息。因此，這種方法具有良好的空間解析度，能夠獲得巨噬細胞和星型細胞的細胞特徵和分析物的分布情況。

這裡還要說到一點，SIMS和上一技術（APIR MALDI/LAESI技術）都可以對三維成像，但兩者也有差別，SIMS方法中，採用高能離子轟擊樣品，逐出分析物離子（二級離子），離子再進入質量分析器。MALDI方法則用激光輻射樣品使之離子化，另外SIMS探針可以探測到100nm的深度，能提供納米級的解析度，而MALDI可以探測更深，但空間解析度較低。

Ⅴ.高靈敏度高解析度——納米結構啟動質譜技術

質譜在檢測生物分子方面有很大潛力，但現有方法仍存在一些缺陷，靈敏度不夠高和需要基質分子促使分析對象發生離子化就是其中之二。比如說，需要溶解或者固定在基質上的方法檢測代謝物，較易錯判，因為這些代謝物與那些基質常常看上去都一樣。另外基於固定物基質的系統也不允許研究人員精確的判斷出樣品中某一分子到底來自於哪兒。

來自斯克利普斯研究院的Gary Siuzdak博士發明了一種稱為納米結構啟動質譜（nanostructure-initiator mass spectrometry，NIMS）的新技術，這種技術能以極高的靈敏度分析非常小的區域，從而允許對肽陣列、血液、尿和單個細胞進行分析，而且還能用於組織成像。

NIMS利用了一種特製的表面，這種多孔硅表面上聚集了一種含氟聚合物，這些分子在受到激光或離子束照射時會猛烈爆發，這種爆發釋放出離子化的分析物分子，它們被吸收到表面上，使其能夠被檢測到。這種方法利用激光或離子束來從納米尺度的小囊中氣化材料，從而克服了一般質譜方法缺少所需的靈敏度和需要基質分子促使分析對象發生離子化的缺陷。

通過這種方法可以分析很多類型的小分子，比如，脂質，糖類，以及類固醇，雖然每一種分析材料需要的含氟聚合物有少許差別，但是這是一種一步法的方法，比MALDI簡單多了——後者需要固定組織，並添加基質。

由於，含氟聚合物不能很好的離子化，因此，會發生輕微的光譜干擾，而且由於離子化過程是「軟性」的——就像MALDI，所以NIMS產生的生物分子是整塊離子化，而不是片段離子化。不過這種技術對於完整蛋白的檢測靈敏度沒有MALDI高。

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