克隆猴在中國率先突破，到底靠的是什麼？

自1997年體細胞克隆羊「多莉」誕生以來，諸如小鼠、大鼠、牛、豬、狗等哺乳動物的體細胞克隆相繼獲得成功，但與人類相近的靈長類動物的體細胞克隆一直未能突破。2017年11月27日，世界上首個體細胞克隆猴「中中」在中國科學院神經科學研究所非人靈長類研究平台誕生，12月5日第2隻克隆猴「華華」誕生（圖1）。2018年1月25日，中國科學院上海神經科學研究所孫強、蒲慕明領導的研究團隊在《Cell》上發表了《Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer》的重要成果，在國際上首次報道利用體細胞核移植技術培育了克隆猴。美國俄勒岡靈長類研究中心著名科學家Shoukhrat Mitalipov隨即在《Nature》高度評價了這項突破。

體細胞克隆猴技術率先被中國科學家孫強率領的團隊突破，誕生了世界首批體細胞克隆猴。中國的克隆技術從跟跑到並跑到領跑，是國家對科技投入持續增加帶來的重大進步，也是國家戰略決策與機遇的必然結果。

圖1克隆猴「中中」和「華華」（圖片來源：《Cell》）

體細胞克隆猴技術及難點

此次體細胞克隆食蟹猴（Macaca fascicularis）使用了類似克隆羊「多莉」的體細胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術，體細胞克隆猴的技術流程如下（圖2），包括體細胞培養、母猴超排取卵、卵母細胞去核和體細胞核移植、體細胞和卵子融合構建克隆胚胎、克隆胚胎激活、胚胎培養、胚胎移植等。取到猴子一個卵母細胞，把細胞核去掉，再把一個體細胞跟去核的卵母細胞融合，構建一個克隆胚胎。然後把這個克隆胚胎激活，讓它像早期的正常受精卵一樣去發育，將克隆胚胎移植到代孕母體，經過卵裂、著床，最後發育成一個個體，新的個體遺傳物質來自體細胞。

圖2克隆猴技術流程圖（圖片來源：《Cell》）

體細胞克隆猴難點主要在3個方面。

一是不同物種之間卵子成熟、胚胎髮育條件都不一樣，需要摸索很多試驗條件。猴子是靈長類動物，資源有限，母猴需要4~5年性成熟後才能超排取卵。試驗時需要大量的母猴超排取卵，也需要大量母猴做代孕。

二是需要熟練的核移植技術人員、手術沖卵和胚胎移植技術人員。本次克隆猴核移植技術人員熟練使用紡錘體偏振光示蹤核物質一次快速去核技術（圖3），雖然不是新的技術，但對於數目有限的珍貴猴卵母細胞，確保每個卵母細胞都去除了核物質至關重要。而經常在克隆豬試驗中使用的盲吸去核法去核率僅有40%~80%，紫外線（UV）示蹤去核法對胚胎的發育有一定的損傷。因此，本研究使用紡錘體偏振光示蹤去核對試驗成功有重要幫助。

圖3紡錘體偏振光去核（圖片來源：《Cell》）

三是猴的體細胞克隆胚胎髮育差。克隆胚胎髮育到囊胚（著床前）效率低，優質囊胚比例更低，是猴胚胎髮育的內在問題，在其供體細胞核的基因組裡存在著重編程抗性區（RRRs）。RRRs的存在阻礙了具有多分化潛能調控功能的基因表達，使得SCNT技術中的重構胚胎髮育受阻，這也是靈長類動物克隆一直無法成功的最大障礙。研究人員發現，向卵細胞導入組蛋白H3三甲基化賴氨酸9（H3K9me3）的去甲基化酶Kdm4和組蛋白乙醯化酶抑製劑曲古抑菌素A（TSA），改善SCNT胚胎的囊胚發育和妊娠率。使用猴成纖維細胞的SCNT實驗中，21隻代孕母猴中的6隻成功懷孕，最終生下2隻健康的猴子「中中」和「華華」。

體細胞克隆動物簡史及克隆猴的回顧

體細胞克隆的歷史要追溯到1952年，Robert Briggs和Thomas King開始進行青蛙克隆的試驗，他們將青蛙受精卵的細胞核移植到卵細胞中並發育出胚胎，成長為蝌蚪，這是人類第1次用細胞核移植技術成功發育出胚胎。那麼成熟的體細胞核能否移植並發育產生克隆動物呢？1958年，英國牛津大學的科學家John Gurdon成功地將蝌蚪腸上皮細胞的細胞核移植到青蛙卵細胞里，並發育出胚胎，2012年獲得諾貝爾生理學獎。哺乳動物的首次體細胞克隆是在1996年由Keith Campbell和Ian Wilmut實現的，他們採用已經分化的成熟的體細胞核（乳腺細胞）通過核移植技術克隆出了「多莉」羊。克隆羊「多莉」是體細胞克隆技術里程碑式的進展，由此之後，小鼠（1998）、牛（1998）、豬（2000）、馬（2003）、大鼠（2003）、狗（2005）等哺乳動物的體細胞相繼成功實現克隆（圖4）。克隆技術已複製了20多種哺乳動物，然而靈長類體細胞核移植的研究似乎並不順利。國內外多個實驗室曾經努力開展克隆猴的相關研究，但均未成功獲得活體。

圖4克隆動物時間年表（圖片來源：《Nature》）

談到克隆猴，最早可以追溯到1997年，美國俄勒岡靈長類動物研究中心孟勵博士作為第1作者報道了通過胚胎卵裂球核移植技術獲得的第1隻克隆猴。2002年，俄勒岡靈長類研究中心研究人員利用猴的體細胞進行核移植試驗，但是沒有進行胚胎移植。2003年，美國匹茲堡大學研究人員進行了克隆猴胚胎的移植，但沒有檢測到妊娠。之後又有多個研究團隊嘗試對猴進行體細胞克隆，最接近成功的有兩次。2004年，新加坡國立大學研究人員將猴卵丘細胞和成纖維細胞核移植到去核的卵母細胞，獲得93枚猴克隆胚胎，移植到31隻代孕母猴體內，檢測到7隻懷孕，但是最終沒有1隻妊娠超過60天。2010年，美國俄勒岡靈長類研究中心再次進行克隆猴的嘗試，將67枚猴克隆胚胎移植到10隻受體猴體內，有5隻檢測到懷孕，其中只有1隻是活胎，可惜在81天時流產。該項目負責人、克隆猴領域曾經的領跑者、曾被科學界認為最可能第1個克隆出猴子的著名科學家Shoukhrat Mitalipov甚至認為，現有技術無法獲得體細胞克隆猴。2006—2007年期間，中國科學家季維智和周琪等合作開展了克隆猴胚胎的基礎研究，發現克隆胚胎的DNA甲基化水平較高。

非人靈長類體細胞克隆主要在美國和中國等國家的不到10家實驗室開展了研究（圖5）。克隆的核心在於，如何讓已經高度分化的體細胞重新變回分化前的狀態，這種類似「時光逆轉」的反自然過程被稱為「重編程」。克隆猴的成功，一個關鍵因素是他們在體細胞核移植體系中充分利用了近年來體細胞重編程的化學手段TSA和Kdm4d的表觀修飾作用，解決了猴體細胞重編程過程中去甲基化、乙醯化的障礙。2014年華裔科學家、美國哈佛醫學院教授張毅實驗室研究發現，在體細胞核移植實驗中，組蛋白H3K9me3的修飾所介導的轉錄沉默是阻擋細胞重編程進行的「屏障」，加入去甲基化酶Kdm4d可以使得重編程效率大大增加。2016年，同濟大學高紹榮團隊也發現，聯合使用去甲基化酶Kdm4b和Kdm5b能極大提高小鼠克隆胚胎的囊胚率及出生率。而早在2006年，日本理化學研究所RIKEN的Wakayama團隊則發現乙醯化酶抑製劑TSA能提高小鼠克隆效率。因此，「中中」和「華華」的誕生是克隆領域近幾年發展的一項集成，離不開科學家們長期以來對克隆胚胎重編程機制的研究。

圖5非人靈長類體細胞克隆主要進展（圖片來源：孫強課題組）

雖然此次體細胞成功克隆了「中中」和「華華」，但目前來看，採用SCNT技術克隆食蟹猴的成功率很低，克隆猴的健康狀況還有待觀察，對短時間內批量化克隆猴持有謹慎樂觀。

體細胞克隆猴的應用及克隆技術的應用現狀

猴和人類非常相似，靈長類動物做疾病模型優勢巨大。目前，常用小鼠作為模型進行人類相關基礎研究，已有大量實踐表明小鼠與人差距較大。克隆猴的成功，將推動中國率先發展出基於非人靈長類疾病動物模型的全新醫藥研發產業鏈，促進針對阿爾茨海默病、自閉症等腦疾病以及腫瘤的新葯研發進程。目前很多疾病的分析方法還沒有在靈長類模型上成熟應用，主要是時間和經費的問題，猴作為靈長類動物，資源有限，世代間隔長，試驗成本高。

豬作為大型動物，資源豐富，繁殖周期短，多胎，飼養成本低，已廣泛應用於人類疾病模型研究，特別是心血管疾病和代謝研究。豬的器官大小和解剖結構與人類相似，是人類異種器官移植的理想供體。克隆豬技術比較成熟，自2000年克隆豬突破後，全世界多個國家獲得了克隆豬，基因敲除克隆豬、轉基因克隆豬的妊娠率目前可達70%~80%。利用克隆豬技術，美國、德國、中國、澳大利亞、韓國、日本等培育了大量的基因修飾豬，美國聯合治療公司在異種器官移植豬方面處於國際領先，將在2019年進行異種器官的臨床試驗。

猴和豬是人類轉化醫學研究的良好大動物模型，小鼠、豬、猴等模型對人類研究的參考價值如圖6所示。

圖6小鼠、豬、猴模型與人類研究的等級關係

總 結

體細胞克隆猴的突破，歸結於中國科學家早在十多年前提出發展大動物（猴、豬）模型戰略的機遇，在中國科學院先導項目專項經費的資助下，孫強團隊在體細胞猴領域歷時5年多終於取得重要突破。其他實驗室也進行了大量探索，並嘗試了表觀遺傳修飾手段但沒有成功，由此看來專註和堅持非常重要，同時也需要一點運氣。

體細胞克隆技術誕生20多年以來，克隆效率還很低，一些克隆動物發育異常的問題也沒有得到顯著改善，如胎兒畸形、器官發育不全、易流產等，克隆重編程機理還不是很清楚。此次克隆猴成功地使用了表觀修飾的化學方法促進體細胞重編程，科學家對「克隆」的干預找到方向，一定程度上提高了猴克隆胚胎效率。同時，非常讓人驚喜的是，克隆胚胎移植後的妊娠率很高，說明中國克隆猴團隊已建立了一套高效克隆猴技術體系。

中國克隆猴成功後，國內外會有更多實驗室跟上，利用更多的資源和人力，進一步優化重編程方法及其他技術環節，再經過一段時間會有更多的實驗室獲得克隆猴。此次成纖維細胞克隆猴的成功，讓我們有理由期待，今後可以在成纖維細胞基礎上進行基因編輯，利用克隆技術培育具有重要研究價值的疾病模型猴。

文 /潘登科，中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，副研究員。中國首例體細胞豬的主要完成人之一，因克隆豬和基因敲除豬的應用而獲得國家科技進步二等獎2項。

注：本文將於近期在《科技導報》發表，敬請關注。

（責任編輯 田恬）

《科技導報》

中國科協學術會刊

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！