基因編輯技術在家畜育種中的研究進展
註：本文摘錄自《基因編輯技術在家畜育種中的研究進展》, 來源：基因組學與應用生物學
摘要：基因編輯技術可以從分子水平上對某個基因進行定點修飾，就可用來改良動物性狀，所以其在動物育種中也起到巨大的作用。
基因編輯技術是在DNA水平上對遺傳進行修改的。相對於RNA干擾(RNAi)、蛋白質阻斷劑等技術而言，可以帶給生物體長久的可遺傳的變異。現在主導的基因編輯技術的核酸酶包括鋅指蛋白核酸酶(zinc-fingernucleases,ZFNs)、轉錄激活子樣效應核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs)和通過sgRNA引導的CRISPR/Cas9核酸酶。基因編輯技術的用途廣泛，包括基因功能研究、基因治療、製作抗體藥物、構建模式動物、改造和培育新品種等。但目前基因編輯技術主要在醫學上運用，在家畜上的運用不多。應用基因編輯技術可對家畜的生產性能進行從分子水平上的改善，還可以培育出抗病性良好的多種家畜等，在育種上發揮了極大的作用。
一、在家畜上的應用
1、牛
Richt等(2007)敲除了牛的PRNP基因，使其腦部的PrPC蛋白表達顯著下降，對朊蛋白造成的瘋牛病起到了有效的預防。Yu等(2011)在應用ZFN技術敲除牛乳中具有致敏性的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)基因，提高了牛奶的營養價值。Jeong等(2016)藉助CRISPR/Cas9技術將人成纖維細胞生長因子2(humanfibroblastgrowthfactor2,hFGF2)基因導入到牛成纖維細胞的β-casein基因內含子中，對牛囊胚進行體細胞核移植，在細胞和胚胎水平上均檢測到hFGF2基因的表達，為最終得到表達人成纖維細胞生長因子2的基因編輯牛奠定了基礎。
有研究表明BMP15和GDF9基因在雌性動物的卵泡發育過程中發揮重要作用，馮萬友(2015)利用CRISPR/Cas9靶向基因編輯技術突變水牛BMP15和GDF9基因，提出了提高水牛繁殖性能的可行性。高旭建(2016)在牛上利用CRISPR/Cas9介導的同源打靶技術,對乳腺特異性表達人胰島素的轉基因動物製備進行了初步研究。在國內對牛Myostatin基因敲除已有一些研究進展，肌肉生長抑制素(MSTN)基因的表達可抑制肌細胞的增殖與分化，通過對MSTN基因的敲除可引起動物表現「雙肌」性狀，對肉牛等肉用家畜的培育起到極大幫助。Wu等(2015)開發利用TALE切口酶技術將小鼠的SP110基因敲入到牛的常染色體中，得到了23頭轉基因牛。
隨後經過體內和體外的轉染實驗，證明了SP110轉基因牛可有效的抵抗牛結核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis,M.bovis)的侵襲，大大提高了牛對結核病的抗性。通過檢測其後代的抗性，證明了該基因可遺傳。Gao等(2017)又首次利用CRISPR/Cas9n技術將NRAMP1(naturalresistance-associatedmacrophageprotein-1,NRAMP1)基因敲入奶牛的基因組中，獲得了抗M.bovis的11頭轉基因奶牛。經檢測11頭奶牛均未檢測到發生脫靶效應，證明了應用這種新型CRISPR技術可減少消除脫靶效應，為研究更多轉基因家畜提供了可能。
2、羊
熊鍇(2013)利用鋅指核酸酶技術敲除了奶山羊BLG基因。Ni等(2014)選擇MSTN(myostatin)、核孔蛋白155(Nucleoporin155,NUP)、BLG和朊蛋白(prionprotein,PrP)基因作為靶基因，利用CRISPR/Cas9技術，對山羊原代成纖維細胞進行了單個基因的單/雙等位基因敲除以及4個基因的同步敲除，對山羊多種有益於人類的多種性狀進行改善。2015年，Cui等(2015)利用TALEN將人乳鐵蛋白(humanlactoferrin,hLF)替換了羊的β乳球蛋白，提高了羊奶的營養價值。皮文輝等(2015)通過構建TALENs電轉染至綿羊成纖維細胞中，經檢測完成了FGF5基因在綿羊成纖維細胞中的起始密碼子ATG定點敲除，為進一步驗證綿羊FGF5基因與羊毛毛長的關係打下基礎。
隨後，阿力瑪(2016)和李佳鑫(2016)等分別利用CRISPR/Cas9技術敲除絨山羊FGF5基因，為培育出高產絨的FGF5基因編輯絨山羊奠定基礎。李聰和曹廣文(2015)成功應用CRISPR/Cas9系統對綿羊MSTN基因進行敲除，證明該系統可以對於綿羊基因編輯，研究產生的突變細胞係為製備MSTN基因敲除羊提供了材料。劉健(2015)利用CRISPR/Cas9技術對絨山羊的胎兒成纖維細胞和肌肉衛星細胞中MSTN基因成功進行敲除。
2016年，影響綿羊毛色ASIP基因編輯產生不同毛色的綿羊在新疆誕生。Fat-1基因表達為ω-3脂肪酸脫氫酶，可使脂肪酸由ω-6形式轉變為ω-3，從而有益於調整動物機體內部脂類代謝。張駒等(2016)通過CRISPR/Cas9編輯技術成功敲除了山羊的MSTN基因，並且在該位點中插入Fat-1基因的載體，用電轉染法將目的基因轉至絨山羊胎兒成纖維細胞中，依靠體細胞核移植法來製備轉Fat-1基因絨山羊，希望選育出既增加羊肉產量又同時提升羊肉中ω-3含量的山羊新品種。
3、豬
在豬到人異種移植中會引起超急性移植排斥反應。Hauschild等(2011)利用ZFN獲得了α-1,3-半乳糖基因敲除豬，為器官移植手術中產生的超急性免疫排斥反應的應對提供了思路。Yang等(2011)研究中將ZFN技術與體細胞核移植技術組合，製備出過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ基因定點突變的敲除豬，有利於研究PPARγ基因在人腦血管疾病中的作用。Hauschild等(2011)又進一步使用鋅指核酸酶技術完成了豬的GGTA1基因的雙等位基因突變，並且發現通過該技術可只經一代的體外核移植得到敲除該雙等位基因的純合基因型。Carlson等(2012)在豬的細胞中實現了TALEN技術介導的多種基因敲除，表明了TALEN技術在豬上應用趨於成熟。
Li等(2014)在豬的基因組中發現了一個ROSA26基因位點，並用TALEN介導的基因編輯技術可進行定點重組酶介導的基因敲入，有助於解決轉基因豬表型不一的問題。阮進學(2015)研究根據基因組編輯技術針對豬H11位點創建了一個高效的定點整合系統，使更為高效安全的製備轉基因豬成為可能。Hai等(2014)對豬的vWF基因構建CRISPR/Cas9系統和顯微注射技術組合一步就成功進行編輯，vWF基因突變的表型出血十分嚴重，為治療血管性血友病提供了相似的模型，證明了CRISPR/Cas9技術在大動物模型構建中的高效性。Marron等(2013)研究發現通過ZFN技術敲除豬的MSTN基因，破壞肌肉生長抑制素的合成，可明顯提高豬的瘦肉率。
我國也有許多研究表明應用編輯MSTN基因可培育出含有「雙肌」性狀的優良豬種群。郭仕妹(2016)首次利用CRISPR/Cas9技術和ssODN成功模擬MSTN基因自然突變，為獲得肌肉表型更明顯的克隆豬奠定了基礎。另外，由於這種基因編輯豬的突變類型是在動物中自然存在的，並已經用於畜牧業生產。因此，通過我們這種模擬自然突變建立的高生產性能豬更容易被人們接受。康難難等(2016)利用顯微注射法將sgRNA和Cas9mRNA注入豬孤雌胚胎，敲除了B2M和CIITA基因，使之主要組織相容性複合體I類與II類分子失去生物活性，進而可抑制T細胞在免疫反應中的強度，成功的實現利用豬單個胚胎進行高效快速的CRISPR/Cas9打靶位點檢測。王敏等(2017)研究發現，RGS雙熒光替代性報告載體的使用可以有效提高CRISPR/Cas9在豬胚胎成纖維細胞中對BMP15基因的打靶效率，為今後通過體細胞核移植技術培育BMP15基因編輯豬，提高母豬繁育能力提供依據。
二、存在的問題及發展前景
基因編輯技術發展至今已達到一定的高度，在建立動物疾病模型、培育新動物品種和治療遺傳疾病等方面有著巨大潛力。但在降低脫靶率、提高特異性以及效率等方面還有不足，CRISPR/Cas9技術雖然比其他技術更為經濟快捷效率高，但在應用於不同對象上時，還應注意使用不同的方法，怎樣完善基因編輯技術降低其脫靶率、提高特異性、增強其普適性成為當前應解決的問題，是否有更為有效的基因編輯技術還有待進一步研究。
三大基因編輯技術在家畜育種中起到了重要的作用，通過基因的敲除(knockout)或敲入(knockin)改變家畜的生產性狀，使之向對人類有益的方向發展。基因組編輯技術被認定成一種理想的基因改造工具，因其效率高、對基因的修飾精確度高而被用於大量的研究。隨著以基因編輯技術為基礎的選擇友好位點、連接多基因、表觀調控等應用的完善，今後動物育種將有可能向規模化、多基因改良的方向發展。經過基因編輯的畜禽可促進畜牧業經濟的發展，為提高人們營養水平和生活質量服務。由此可知，基因編輯技術已成為現代生物研究的重要手段之一，為了更好地為科學研究提供良好的平台，完善發展基因編輯技術成為了重中之重。
作者：徐嘉威，賀花，沈雪梅，劉鯤鵬，雷初朝，陳宏，黃永震
單位：西北農林科技大學動物科技學院, 西北農林科技大學動物醫學學院
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