至本醫療CEO王凱論述二代測序在癌症精準醫療中的應用：中國的現狀與未來

最新 02-13

Next-generation sequencing–based testing for cancer precision medicine in China: A review of technologies and validation procedures

王維鋒，哈佛大學Dana Farber 癌症研究所博士後研究員

施巍煒，耶魯大學癌症中心教職研究員；德州大學MD安德森癌症中心高級生物分析員

姚鳴，浙江大學&第二軍醫大學免疫學國家重點實驗室博士

王凱，哈佛大學Dana Farber 癌症研究所博士後研究員

由左至右分別為王維鋒、王凱、姚鳴、施巍煒

二代測序（next-generation sequencing，NGS）的檢測速度和通量與傳統測序技術相比有了大幅的提升，從而促進癌症基因組學研究飛速發展，幫助人們對癌症有了更深入的認識，也使得基於分子和臨床數據相結合的個體化精準醫療成為可能。近年來，NGS在歐美已被證實是一種準確可靠的診療相關技術，但NGS技術在中國臨床應用的發展仍然面臨著許多挑戰，如NGS質量控制體系、生物信息分析流程、基因變異臨床意義注釋、測序平台和檢測範圍的選擇等。在此，我們對NGS在中國的癌症精準醫療領域的現狀和挑戰做一綜述，並展望未來的發展前景。

NGS的技術優勢

NGS是一種準確高效和高性價比的新檢測技術，可以通過對癌症患者的組織或體液進行檢測，發現基因組水平的變異等分子信息，輔助癌症診療。癌症生物學認為，體細胞基因突變是導致癌症發生和發展的原因，但在NGS技術出現以前，對腫瘤組織進行全面的基因檢測幾乎是不可能的。主要的制約是早期的測序技術，如Sanger測序法，一次檢測僅能對單個基因部分區域進行檢測，可檢測的基因變異類型單一，不但費時費錢費力，其檢測的覆蓋範圍和準確性也很難達到臨床要求。而NGS技術則可以一次性檢測出目標基因的幾乎所有類型的基因變異，包括鹼基置換、片段插入或缺失、基因拷貝數變異、基因融合或重排等，進而繪製出一張比較精確和全面的癌症基因變異圖譜，並且大大降低時間和費用。

NGS檢測基因檢測技術在癌症精準醫療領域已經有很多成功的臨床應用實例。例如，近年來得益於NGS基因檢測技術，我們已發現表皮生長因子受體（EGFR）基因的多種不同形式的基因變異，進一步證實這些不同的EGFR基因變異在多種腫瘤的發生髮展中發揮重要作用，並且陸續開發出了多種針對EGFR基因變異的治療方法並廣泛應用在臨床。這些基於NGS技術不斷被發現的EGFR基因變異形式包括鹼基置換（1, 2）、片段插入或缺失(3)、蛋白功能區域重複(4)和融合(5)等（圖1）。由此可見，對患者進行複雜的基因變異圖譜檢測，離開NGS技術是不能實現的。研究人員針對EGFR各種變異開發了相應的酪氨酸激酶抑製劑（TKI），在臨床上取得了良好效果，這極大鼓舞了人們對精準醫療的熱情，也使得基於基因和細胞特徵的個體化精準醫療得到了廣泛的推廣。基於NGS檢測的精準醫療也已經成為部分晚期癌症的一線治療方案。同時，NGS技術也可以鑒定和發現新的癌症驅動基因變異和非驅動變異，不斷擴展我們對癌症分子機制的認知。

圖1. 近15年

EGFR基因的多種變異檢測和相應靶向治療重要歷史事件時間表

通過全球性項目和組織，如2005年開始的癌症基因組計劃（TCGA）和2008年成立的國際癌症基因組聯盟（ICGC）以及蓬勃發展的生物信息學數據分析，研究人員構建了基於NGS檢測技術的多個癌症類型的基因變異圖譜。在癌症精準醫療中，NGS的基因變異檢測不僅可以幫助發現新葯研發的潛在靶點，也是合理進行用藥選擇、療效預測的重要依據之一。目前在非小細胞肺癌（NSCLC）的治療中，EGFR和間變性淋巴瘤激酶（ALK）基因變異檢測已成為一種臨床常規的檢測，相應的靶向治療也已經成為一線治療方案，極大提高了患者的生存率和生活質量。此外，NGS基因檢測可以同免疫治療（如PD-1/PD-L1抑製劑）結合起來，篩選出攜帶相關基因變異特徵的患者，使得免疫治療達到更好的治療效果，比較有代表性的是基於NGS的腫瘤突變負荷（TMB）和微衛星穩定性（MSI）檢測。腫瘤突變負荷（TMB）是指每單位鹼基（一百萬鹼基）中被檢測出的體細胞基因突變的總數，可用於預測免疫治療的效果 (6)。微衛星高不穩定狀態（MSI-H）主要是由DNA錯配修複復合體蛋白缺失 (dMMR）引起的在基因組中微衛星序列上發生廣泛插入/缺失的一種突變狀態(7)。2017年6月，美國食品和藥品管理局（FDA）審批通過了免疫檢查點抑製劑pembrolizumab在表現為MSI-H/dMMR的各種腫瘤類型中的治療應用。這是歷史上第一個不限定傳統意義上的腫瘤組織類型，僅基於同一種生物標誌物，可廣泛用於各種腫瘤類型的抗癌藥物。這些前期研究為進一步基於基因變異分析的精準醫療包括免疫治療的大樣本臨床研究奠定了基礎。

隨著獲批上市的靶向藥物的增多，以及NGS檢測技術推動下，生物標記物發現速度的提高，美國國立綜合癌症網（NCCN）更新其官方的臨床治療和檢測推薦指南的速度也越來越快（圖2）。例如，MET基因的14號外顯子跳躍突變 (Exon 14 skipping)是RNA轉錄剪接缺陷引起非小細胞肺癌（NSCLC）的一種結構性基因變異。臨床研究顯示，在攜帶此類MET基因突變的癌症患者中，MET抑製劑治療可帶來顯著臨床獲益。在研究論文和案例報道後幾個月的時間內，這一基因變異的檢測即被NCCN指南推薦(8)。NGS技術不僅可涵蓋所有NCCN推薦的基因變異檢測，同時具有很大的靈活性，還可篩查更多的未知變異。Larotrectinib是第一種針對神經營養性酪氨酸受體激酶（NTRK）基因與其他基因形成的融合蛋白的小分子抑製劑。臨床試驗結果顯示，通過NGS檢測，針對攜帶NTRK融合的17種不同組織來源的腫瘤患者（包括成人和兒童），larotrectinib均顯示一致和持久的抗腫瘤活性。因此，在不遠的未來，利用NGS技術一次性檢測NTRK融合、TMB或MSI-H等生物標記物，有可能在NCCN的官方指南中得到推薦（圖2），這將有利於臨床醫生更加精確、快速地鑒別患者的基因突變類型，並選擇更有效的個體化治療方案。

圖2. NCCN推薦的非小細胞肺癌（NSCLC）基因檢測逐年增加的時間表

NGS是一種簡便易行的通用型檢測手段，可同時檢測靶向治療和免疫治療的靶分子或生物標記物。與傳統分子檢測，如熒光原位雜交（FISH）和多聚酶鏈反應（PCR）等相比，NGS的檢測通量顯著提高。FISH主要檢測已知基因的擴增和重排，而PCR則只能檢測單核苷酸變異和已知的插入或缺失（表1）。迄今為止，NGS是本領域最好的分子診斷技術，可以在一次檢測中覆蓋所有類型的基因改變。相對於傳統檢測方法，NGS技術的性價比最高。

表1. 多種檢測技術臨床應用的比較

NGS應用面臨的挑戰

癌症目前是中國最大的公共健康問題之一。最近的調查報告顯示，癌症是目前農村排第一位的死亡原因，每天新診斷病例為12,000例(9)。作為發展中國家，並擁有全球最大的癌症患者群，中國迫切需要為患者提供精準有效的醫療技術。在傳統化療的基礎上，靶向治療近年來有所增長。不同癌症患者的基因變異特徵有很大不同，也就是說，同一種癌症有可能需要不同的靶向治療策略。因此，針對不同患者的特徵性治療靶點，採用精確且特異性的臨床靶向治療是精準醫療成功的關鍵。這對於中國這樣醫療經費並不充足的發展中國家尤其重要。美國的許多大醫院和癌症中心都已經建立起了針對幾百個癌症基因的NGS檢測平台，中國的臨床分子診斷實驗室也已經引入了NGS並開始應用。目前NGS技術是精準醫療的研究熱點，吸引了醫生、科研人員和企業的廣泛關注，這些關注可以進一步推動NGS的發展並形成良性循環。

在中國，NGS基因檢測還是一種新興產業，無論是技術還是管理層面都面臨很多挑戰。首先，並不是所有的檢測機構都可以保證其NGS檢測質量。當面臨激烈的市場競爭和尚不嚴格的法規監管時，很多機構不清楚或者放鬆了最基本的質量控制標準。2015年，中國衛生部國家臨床實驗室中心提供標準樣品，對從業實驗室進行了一次全國性外部客觀質量評估，僅27%的實驗室檢出了全部突變。這促使中國抗癌協會臨床腫瘤學協作專業委員會（CSCO）和中國癌症驅動基因分析聯盟（CAGC）加速發布了《二代測序技術應用於臨床腫瘤精準診治的共識》。同樣，在2017年，美國分子病理學學會（AMP）和美國病理學家協會（CAP）聯合發表了NGS癌症基因組檢測和分析指南 (10)。該指南著重強調了標準NGS操作流程的建立和可靠的NGS設備是獲取準確檢測結果的保證。NGS檢測的每一個步驟都應該制定嚴苛的操作標準和質控流程，這些步驟包括樣品製備、NGS文庫構建、NGS測序、生物信息學分析、臨床注釋和報告。此外，還需要強調的是，需要建立NGS檢測外部有效性的標準，包括標本的類型和數量、檢測的可重複性、可報告範圍、對照範圍（健康人群的基因變化譜）、檢測的局限性、干擾因素、檢測敏感性和特異性、必要時以生物信息學流程和其他參數進行驗證(11)。至本醫療科技（OrigiMed）一直認為NGS的臨床檢測不同於普通的NGS測序，NGS的臨床檢測更加需要嚴謹的設計、充分驗證的檢測平台和經過訓練的操作者執行以及完善的基礎設施支持。同時，對每個基因變異的描述和臨床注釋以及潛在分子治療靶點或信號通路的解讀也非常關鍵。

測序覆蓋深度（depth）和範圍（coverage）是NGS技術的兩個關鍵指標，對質量和成本會產生較大的影響（表2）。不同的檢測類型覆蓋不同數量的目標基因，檢測範圍可以從幾個基因、幾百個基因，到所有基因的全外顯子測序（WES），甚至是全基因組測序（WGS）。檢測類型的選擇要與臨床檢測目標相適應。僅檢測少數基因有可能造成臨床診斷證據獲取不充分，而檢測基因過多則可能產生冗餘的信息或減少真實、有臨床價值的信號。具體而言，大範圍測序產生的過度基因組信息僅能提供有限的額外臨床價值，但同時解釋未知或不確定的偶然發現基因變異的臨床意義會帶來巨大的工作量。另外，由於需要對數據進行有效的分析，NGS檢測必須保證一定的測序深度，如果檢測深度不夠，則可能導致檢出率大幅降低而最終丟失陽性結果。例如，測序覆蓋深度小於300倍，只能檢出84%的低頻單核苷酸變異（SNV），而短序列插入/缺失的檢出率會更低（12）。既往的研究表明，低覆蓋深度的WGS/WES或捕獲測序無法發現可用於藥物治療的低頻基因變異，影響臨床靶向藥物的選擇並使患者失去治療的機會。另一方面，基因融合，例如可以指導一線用藥的ALK基因融合，其融合斷點常常位於基因內含子區域，僅使用覆蓋基因外顯子區域的常規WES是無法有效檢出的，除非融合斷點恰巧位於非常接近基因外顯子的近端。

表2. 中國目前檢測不同基因數目的各種測序panel比較

一些針對單一特定癌症種類而設計的NGS測序的基因數目一般很少，例如只檢測10個左右的基因變異情況，甚至僅覆蓋這些基因的熱點突變區域，雖然價格較低，但是必然會遺漏很多其他關鍵基因變異信息而減少患者臨床藥物選擇的寶貴機會（表2）。而且基因數目太少也不能有效計算TMB這一重要的免疫治療療效預測指標。所以為了最大限度和準確地增加患者的治療選擇，至本醫療科技一直致力於推薦使用包含幾百個癌症基因的NGS檢測。至本醫療科技的元溯450可以一次性檢測450個癌症相關基因的各種變異情況，並分析TMB、MSI和潛在的免疫治療耐受基因變異（也可以聯合RNA測序檢測更多的基因融合和RNA剪接突變）。

NGS檢測在中國的現狀與未來

2015年，中國科技部召開了第一次「國家精準醫療戰略專家會議」，成立了中國精準醫療戰略專家委員會。大會最主要的成果之一是，政府計劃在2030年前，在精準醫藥領域投入600億元人民幣（92.4億美元），其中關鍵領域之一便是NGS檢測。

中國將擴大NGS檢測在精準醫療領域的應用，特別是癌症方面。美國的Illumina公司目前佔有最大的測序硬體市場份額，在中國有數百台NGS測序儀；而其他公司則提供了大量的試劑和耗材。近幾年有數家國內公司開始進入NGS上游市場，超過10家公司在研發測序儀，部分已獲得CFDA批准上市，如華大基因和博奧生物。中國在測序服務和臨床檢測方面也缺少良好的培訓和監管規則。中國目前大約有數百家提供測序服務的公司，基本上全部分布在大城市，並且大部分尚沒有為測序數據分析建立外部可信度標準和自我的檢測體系。

NGS檢測的臨床應用方面，中國仍然落後於美國。中國的絕大多數醫院還是只能依賴於傳統的分子診斷技術，如PCR、免疫組化和FISH，以此作為主要的癌症相關檢測方法。造成這種現象的主要原因有三個：首先，NGS檢測涉及一系列的操作步驟，包括樣本製備、文庫構建、測序、生物信息學分析和臨床報告解讀，每一步都需要嚴苛的操作標準、質量控制和質量評價。目前中國的大多數醫院的實驗室尚不具備這些必需的條件。因此，近幾年來商業化測序服務機構如雨後春筍般出現，但是僅有少數公司具備規範的分析和解讀臨床測序結果的能力。另外，NGS檢測結果的重要性也未被大多數的中國醫生所認識。其次，FDA已批准了大量的靶向和免疫治療藥物上市，更多的藥物也已進入臨床試驗，但是很多新葯在中國人群的使用經驗相當少，因而醫生和患者更傾向於選擇傳統和保守的方式如單基因檢測，而不是選擇必要的、臨床樣本消耗更少的一次性針對幾百個癌症基因的精準NGS檢測。最後，NGS檢測尚未被醫療保險覆蓋，NGS檢測的費用對低收入群體來說還是偏高。根據檢測通量和性質的不同，一個全面的NGS臨床檢測產品的花費通常在1~2萬人民幣。

儘管NGS檢測技術用於癌症尚處於早期的發展階段，但在世界範圍內已迅速成為臨床診療不可獲缺的一部分，在中國也已經看到了明顯的趨勢。可以預期的是，中國的學術機構和企業會繼續努力開發測序硬體和相關試劑。更重要的是，中國已下決心擴展NGS檢測在學術研究和臨床診斷中的應用，主要包括探索癌症的病因和發病機制、在基因組測序的基礎上為癌症患者的個體化治療提供基於基因、整合多種NGS檢測技術的輔助，推動傳統臨床醫療研究。這必將在包括疾病診斷、治療和臨床決策等各個領域推進中國精準醫療的進步，造福中國廣大的癌症患者。

展望

NGS檢測技術是近年來癌症研究和臨床應用領域最令人興奮的巨大進步。它提供了一種更全面和高效的方法來檢測癌症患者個體的基因組分子特徵，並可以據此選擇適合病人的個體化精準治療方案，從而不斷地推動著癌症精準醫療的革新。雖然大多數中國的醫院目前缺乏開展複雜NGS檢測的一些必要因素，但隨著政府、科研機構和公司的共同努力和探索，癌症精準醫療在中國的發展正在加速，越來越多新的檢測領域也開始出現，如循環腫瘤DNA（ctDNA）、外泌體和表觀遺傳學檢測等。在不遠的未來，我們可以預見：每一個癌症患者都會常規性地進行全面的基因變異檢測，通過不同的檢測技術來及時和動態地發現患者體內的各種分子水平的異常，從而輔助醫生設計符合每個不同階段患者的個體化精準治療方案。

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