聚焦液體活檢重磅成果與技術革新

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HAPPY NEW YEAR

去年小編朋友圈被刷的最多的就是免疫治療，但不能迴避的事實是，癌症靶向藥物和免疫治療只能延長患者的生存期，治療產生的副作用讓患者的生活質量下降，而高額的醫療費用也是整個家庭和社會的巨大負擔。大家都知道，早期癌症的治癒率是非常高的，所以，更早的發現癌症是科學家們孜孜不倦的追求。

文末有驚喜！

圖一. 液體活檢資源庫[1]

隨著微流控、ddPCR、基因測序和蛋白分析等技術的逐步成熟以及研究的深入，液體活檢關注的生物標誌物不再局限於CTC、外泌體核酸、ctDNA以及miRNA，科學家們還進一步挖掘癌細胞隱藏在外泌體、血小板中的蛋白或mRNA信息，此外，兼具診斷和定位功能的ctDNA甲基化標誌物也大放異彩，現在，我們不但掌握了更加全面的癌細胞指紋（ctDNA突變，ctDNA表觀修飾等），而且還能通過審訊被癌細胞洗腦的不堅定分子（血小板）以及監聽癌細胞的通訊系統（外泌體）等手段診斷癌症，最後，振奮人心的多標誌物聯合診斷為2017中國年完美收官。接下來，小編憑藉有限的智慧，和大家分享一下對過去一年液態活檢中癌症診斷方面的研究進展的感想。

DNA錨定技術革新-全面提升NGS檢測能力

經過十年的發展，NGS的文庫構建技術已經相對完善，但是微量或是單鏈核酸的建庫技術相對缺乏，而這恰恰又是目前測序技術深入發展所迫切需要的，比如高準確性的單細胞DNA測序技術，高效的單細胞轉錄組以及更靈敏的甲基化測序技術等等。2017年4月，Science報道了謝曉亮院士團隊的LIANTI單細胞DNA測序技術[2]，該技術將轉座酶的DNA 5』錨定能力，帶有「MALBAC」屬性的T7接頭以及線性擴增技術巧妙的結合起來，大幅提升測序準確性，為真實還原單細胞DNA序列提供了可能。2017年8月，Science發表了一種高效的單細胞DNA甲基化測序技術[3]，該技術填補了目前急需的高靈敏高通量DNA甲基化測序技術的空白，流程中的3』錨定模塊不但豐富了我們對核酸分子的操控手段，還可進一步提升DNA、RNA測序的數據質量。

圖二. LIANTI和snmC-seq技術的核心模塊[2、3]

癌症指紋守衛者-外泌體/血小板

經常看到一個說法，將ctDNA比喻為癌細胞撒向血液中的漂流瓶。其實，外泌體或血小板更像是漂流瓶，因為正是由於生物膜的保護，那些癌細胞特有的，但容易被破壞的蛋白質、RNA等作案證據才能最終被發現。2017年3月，PNAS發表的一項研究中，研究人員通過比較乳腺癌患者和正常人血漿囊泡的磷酸化蛋白組，發現了一百多個在患者中顯著升高的磷酸化蛋白[4]。這在以前是很難想像的，蛋白的磷酸化修飾是細胞信號通路的開關，它也是癌細胞中最常見的變化之一，但是正常情況下，血液中蛋白磷酸化修飾會被大量存在的磷酸酶抹去，「漂流瓶」的保護讓隱藏的癌細胞蹤跡重見天日。

檢測血漿中非遊離狀態的mRNA原理類似，我們可以通過外泌體mRNA了解癌細胞基因組改變，指導癌症治療；還可以監測受癌細胞影響的其他細胞的轉錄組改變，間接診斷癌症的發生、發展，比如荷蘭的Thomas Wurdinger團隊基於血小板mRNA開發了ThromboSeq技術來診斷非小細胞肺癌。不過，此項研究以及2015年同樣發表在Cancer Cell的血小板RNA研究工作都由Thomas Wurdinger團隊完成，目前跟進的實驗室較少，究竟血小板RNA標誌物能走多遠，讓我們拭目以待。

圖三：胞外囊泡保護蛋白磷酸化修飾[4]

腫瘤定位-讓癌症早篩不再是空洞的概念

液體活檢的終極目標一定是癌症的早期篩查，如果發現了癌症卻不知道腫瘤在哪裡，我們就無法對癌症進行干預，這種早期篩查是沒有任何實際意義的，而最先進入科學家視野的ctDNA突變並不具備定位腫瘤的能力，這也是人們最擔心的問題。2017年3月，張鵾教授團隊向全世界宣告，ctDNA甲基化標誌物也可以做到這一點[5]。除了ctDNA甲基化，2015年Cancer Cell報道的血小板RNA研究以及2018年剛剛發表在Science的多標誌物聯合診斷研究表明，多種生物標誌物均具有定位腫瘤的能力[6、7]，液體活檢可以朝著終極目標繼續前行。

圖四. ctDNA甲基化標誌物可對癌症追根溯源[5]

齊頭並進-多種生物標誌物百舸爭流

回顧2017，科研人員在液體活檢領域取得了多項階段性成果，比如利用血小板RNA診斷非小細胞肺癌[8]、通過檢測cfDNA中的EB病毒基因篩查鼻咽癌[9]、基於ctDNA甲基化診斷肝癌[10]、憑藉新型蛋白組學技術篩選出超高特異性的卵巢癌標誌物[11]等等，除此之外，基於多種miRNA的肝癌診斷試劑盒喜獲CFDA審批。我們不難發現，圍繞著遺傳中心法則，通過檢測癌細胞特異的DNA、表觀修飾、RNA以及蛋白質改變，科學家們已經對癌症築起了初具規模的監控網路，可以全方位捕捉癌細胞的蛛絲馬跡，所以，我們向提前預警癌症又邁出了一大步。

液態活檢哪家強？-聯合診斷

對於液體活檢，核酸還是蛋白標誌物更好？為了回答這個問題，多年以來科學家們將現有技術發揮到了極致。

核酸類生物標誌物檢測的最大瓶頸是其含量低，一個細胞只有一套基因組，早期癌症患者每毫升血漿可能只有一個份癌細胞基因組拷貝，而且頻率低於0.1%，而測序儀的錯誤率已經在0.1-1%，所以，有兩個問題需要解決，即能不能抓到這一個拷貝，以及這個拷貝是不是真實的。研究人員運用錨定PCR或環化等技術提高對DNA的捕獲能力，同時利用單分子標籤降低測序噪音，2016年報道的iDES技術已經將檢測靈敏度突破至0.004%[12]。

圖五. NGS低頻突變檢測的代表技術[12、13]

優化了檢測技術，接下來要面臨的就是生物學問題，同一種癌症在不同患者中常常具有不同的突變位點，所以，往往需要聯合多個驅動基因靶標進行ctDNA突變分析，以提高檢測靈敏度，降低漏檢率，這種聯合策略在之前的蛋白類標誌物研究中也很常見。有意思的是，對ctDNA甲基化的研究中，這種聯合思想被多次應用 [5]，首先，聯合多個CpG形成加強型信號小單元（甲基化單倍型），再對多個小單元進行聯合分析，利用ctDNA甲基化診斷肝癌的靈敏度大於80%、特異性超過了90%，而且對於肝癌和其他肝臟疾病也有很好的區分度[10]。

圖六. ctDNA甲基化檢測原理及其優異特異性

那麼，DNA、RNA、表觀修飾、蛋白標誌物孰優孰劣呢？聯合檢測方案悄然給出了答案--「兩顆在一起吃才更好」！2017年5月，由約翰霍普金斯大學Bert Vogelstein和Nick Papadopoulos領導完成，發表在PNAS的一項早期胰腺癌聯合診斷研究中，單獨使用ctDNAKRAS突變或CA19-9進行診斷的靈敏度分別為30%和49%，而當聯合使用時，靈敏度提升至64%，特異性在99%以上（221例癌症組/182例對照組）[14]。

圖七. ctDNA聯合蛋白標誌物提高早期胰腺癌診斷靈敏度[14]

如果說這項研究只是小試牛刀的話，在2018年春節前，我們有幸見證了具有里程碑意義的癌症診斷技術的出現，即CancerSEEK，一種加強型多標誌物聯合診斷，聯合ctDNA突變（16個基因）和蛋白質（8種）標誌物，該技術對8種癌症具有較高靈敏度（中位70%）和超高特異性（99%），相關研究於2018年1月發表在Science雜誌[7]。CancerSEEK彙集了人類在核酸和蛋白質分析技術上取得的成果，在某種意義上，它是對為攻克癌症而不懈努力的廣大科研工作者的一種褒獎。

圖八. 聯合診斷更新換代[15、16]

值得一提的是，該研究還有一個令人深思的細節。在812例健康對照組中，只有7名健康人被「誤診」為患有癌症，雖然這些被「誤診」的個體可能真的患有癌症，只是目前技術無法檢測，也就是說特異性為100%，但在統計時，研究人員還是保守的將這7例判定為「誤診」。上述的重點不是如何統計，而是在液體活檢技術應用於癌症早期篩查時，如果早到連現行技術都無法辨識，醫生只能告訴受檢者觀察一段時間再來複查，相信大家都不會買單。所以，液態活檢應用應該是從癌症的伴隨診斷、輔助診斷、高危人群篩查再到普通人群篩查，以循序漸進的方式推進，並以干預和治療手段為基礎，避免有診無治的尷尬。

圖九. 多種組學數據日益豐富[17]

挑戰與展望

最後，我們從靈敏度（漏檢），特異性（誤診）兩個方面，看看如何提升基於核酸標誌物的癌症診斷技術。

就靈敏度而言，在基因組學層面，同時檢測多個點突變、拷貝數變異等多個特徵可以進一步提高靈敏度；此外，在轉錄水平上，雖然一個癌細胞只具有一份基因組拷貝，但從DNA上轉錄出的mRNA數量會大幅提升，再加上外泌體保護，讓腫瘤mRNA的檢測更加可行；值得注意的是，在表觀方面，雖然有技術層面的限制，候選位點更為龐大的ctDNA表觀修飾標誌物值得期待。在2018年，我們可能會看到更多標誌物內部或標誌物之間組合優化的研究。除了利用癌細胞自身的信息，從癌細胞的環境入手，間接檢測癌症也是科學家在探索的方向。

對於癌症診斷的特異性，目前研究仍然有一些局限性，一方面，我們選擇的標誌物並不特異。由於技術條件限制，篩選標誌物的方法較為粗放，通過整個腫瘤組織獲得的差異信號魚目混珠，除了癌症，其他疾病以及人體在響應其他外界刺激時也會產生類似的信號。另一方面，同樣是由於技術的限制，我們只能分析一部分候選靶標，例如，基於ctDNA甲基化的肝癌診斷研究中，由於探針設計的困擾，科研人員只能對約40%的靶標進行驗證[10]。除此之外，在驗證標誌物特異性時我們選擇的人群又「過於健康」。比如2018年剛發表的ctDNA和蛋白質的聯合診斷研究中[7]，雖然特異性大於99%，但是，這些健康對照組人群是完全健康，不具有任何炎症或是其它疾病，在臨床應用時，特異性可能會不如預期。

圖十：人類細胞圖譜計劃引爆單細胞測序新時代

所以，從單細胞水平全面獲取人體的遺傳圖譜勢在必行，比如從癌前病變進階為惡性腫瘤過程中，病變細胞的單細胞多組學全景掃描，腫瘤微環境的系統研究等等，相信隨著人類單細胞計劃的開展，能幫助科學家掌握癌症更加特異的指紋；此外，這些研究成果在轉化時還需要更符合臨檢需要的檢測技術來實現；最後，希望更大規模的臨床研究能早日完成，讓更加完善的檢測技術服務廣大人民群眾。

參考文獻

[1] Tumor-educated platelets as liquid biopsy in cancer patients. 2015 Cancer cell

[2] Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI). 2017 Science

[3] Single-cell methylomes identify neuronal subtypes and regulatory elements in mammalian cortex. 2017 Science

[4] Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. 2017 PNAS

[5] Identification of methylation haplotype blocks aids in deconvolution of heterogeneous tissue samples and tumor tissue-of-origin mapping from plasma DNA. 2017 Nature genetics

[6] RNA-Seq of Tumor-educated platelets enables blood-based pan-Cancer, multiclass, and molecular pathway cancer diagnostics. 2015 Cancer cell

[7] Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. 2018 Science

[8] Swarm intelligence-enhanced detection of non-small-cell lung cancer using Tumor-educated platelets. 2017 Cancer cell

[9] Analysis of Plasma Epstein–Barr Virus DNA to Screen for Nasopharyngeal Cancer. 2017 NEJM

[10] Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. 2017 Nature materials

[11] Selected reaction monitoring approach for validating peptide biomarkers. 2017 PNAS

[12] Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. 2016 Nature biotechnology

[13] Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. 2014 Nature medicine

[14] Combined circulating tumor DNA and protein biomarker-based liquid biopsy for the earlier detection of pancreatic cancers. 2017 PNAS

[15] Prospective evaluation of the contribution of K-ras mutational analysis and CA 19.9 measurement to cytological diagnosis in patients with clinical suspicion of pancreatic cancer. 2000 European Journal of Cancer

[16] Evaluation of DNA from the Papanicolaou Test to Detect Ovarian and Endometrial Cancers. 2013 Sci Transl Med

[17] Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. 2017 Cell

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