饒毅：三十年前做基因測序和「基因治療」

當年的實驗記錄本

導讀：

1988年2月22日，我對自己新發現的基因開始準備進行基因測序，這一工作遇到困難，終於在1988年8月8日完成。

其後，我做了轉基因，將我克隆和分析過的DNA導入動物體內，它可以「治療」動物腦發育的「疾病」。

撰文 | 饒 毅（《知識分子》主編、北京大學教授）

責編 | 葉水送

知識分子為更好的智趣生活 ID：The-Intellectual

1985年的秋天，我到美國舊金山加州大學（UCSF）做研究生，第一個學期的第一個研究在神經生物學計劃主任Zach Hall的實驗室輪轉。在那裡，我做了一生第一次的DNA實驗：將一段DNA切下轉到另外一個載體。第一次見到DNA，我很激動，此前我在中國讀過文章，但沒有做過DNA實驗。那時，誰如果克隆一個新基因的DNA已是了不得，等到1991年我研究生畢業時，克隆基因雖然還重要到可以上Nature雜誌，但已經不如最初那麼顯眼，而需要看克隆的基因有多重要、克隆過程有多難。

1986年至1987年，我在實驗室的工作很不順利。

C13b CDNA測序記錄

1987年，我的課題走上軌道，我研究一個控制果蠅神經系統發育的基因big brain（bib），這一基因突變後，果蠅的神經系統增加，表皮減少，這是因為早期發育中前體細胞要決定成為神經細胞還是表皮細胞，bib基因產物參與了這一調控環節。bib基因的突變由德國科學家首先發現，但沒人得到bib基因的DNA序列（簡稱克隆基因）。

1987年，我在詹裕農、葉公杼實驗室，因為有轉座子P因子插入bib基因的果蠅突變種，所以可用分子生物學的方法很快拿到bib基因及其附近區域的DNA，然後從前人積累的幾個品系的bib基因突變種中取得它們的DNA，檢查它們分別在哪裡有DNA變化，從而推測bib基因的DNA是哪一段。這與人類遺傳疾病的致病基因研究方法在原理上是一樣的，但果蠅更好分析，因為可隨研究者的意願進行各種交配。當然在人裡面不能按研究者的安排來雜交，只能接受現實，所以分析麻煩些，但本質相同。

1987年，我拿到了含bib基因的基因組DNA（genomic DNA，gDNA），然後用它做探針，篩選互補DNA文庫（complementary DNA，cDNA）。cDNA是科學家通過用體內的信使RNA（messenger RNA，mRNA）進行逆轉錄，得到與mRNA序列互補的cDNA，建成雙鏈DNA的文庫，便於擴增和使用。我也很快找到了bib基因的cDNA，以後用的克隆碰巧是第13號，我稱之為c13，它不長，只有3.4 kb（3400個鹼基對）。

在得到c13的cDNA後，應該可以很快進行序列分析（DNA測序）。但是因為一個技術環節的問題，我從1988年2月22號到6月26號來回兜圈，可謂氣惱。DNA測序不能線性、一次順序檢測，而需要一段一段（一般幾百鹼基對的長度）。為了保證這一段一段有次序，一個巧妙的方法是從一個長的DNA一端開始，做順序性的切除，這樣每一個切除後的產物比前面一個短一些，從同一端測序的話就正好相當於一段一段地測序。這個方法聽起來很簡單，特別是當有人發明這一方法之後，但裡面有個小的技術環節，進行順序切割的外切酶只要DNA有缺口就繼續切，而一般製備的DNA常常有缺口，需要用CsCl（氯化銫）中超速離心的DNA（專業辭彙是CsCl banding）才能把沒有缺口的優質DNA與其他分開，這一細節當時不是所有人都記得，因為此前DNA常規都用超速離心機進行CsCl分層，而小型離心機當時是很新的應用，小型離心機的DNA對一般很多實用是可以用的，但含缺口，就會碰到外切酶到處切的問題，得到的DNA就不是順序的，而是亂七八糟的。這個小的細節讓我浪費了四個月的時間，最後有人提醒，一經改變，馬上就順利了。

Sanger測序的典型結果（這張是原始結果之一，不過不是我研究生期間的，很可能是九十年代的）

常用的測序法是英國科學家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）於1977年發明的，他部分依據於吳瑞發明的引物延伸（Primer extension），加上Sanger自己發明的雙去羥基法。測序的過程要用同位素S35，這不是很大的問題，因其放射性很弱。而測序需要用玻璃板比較長，且需要洗得很乾凈，是個體力活：樣本上好之後，需要幾千伏的高壓電泳，一般晚上上樣，隔夜跑電泳，第二天早上以後進行同位素曝光和分析。

1988年8月8日，我的筆記本總結bib基因的cDNA全部序列分析清楚了。

1987年，我克隆出bib基因，1988年中完成對其DNA序列的分析，此後做了其轉基因，將bib的gDNA導入到果蠅中，1988年底得到轉基因的果蠅。

我將bib基因裝入含轉座子P因子的轉基因載體，注入果蠅胚胎中，得到嵌合體，嵌合體的鑒定是通過轉基因載體另外所含的導致眼睛顏色變紅的基因（名稱為white，缺乏這一基因的果蠅是白眼，給予white基因後就恢復紅眼）。因為培育出果蠅後還需要交配傳代再鑒定，時間需要幾個月，一直延續到了年底。我遇到了困局：年底還要不要出去旅遊，去不去亞利桑那州的大峽谷。

想想轉基因果蠅的特點，我可以做到工作、旅遊兩不誤。把果蠅帶在車上，照樣去亞利桑那州的Tucson，當時梅林在亞利桑那大學念研究生。

這個實驗比較容易，只要在簡單顯微鏡下看看有紅眼果蠅，就知道拿到了轉基因果蠅，從而挑出它們與野生型的果蠅交配就可以了。實驗需要很簡單，所以帶著它們在其他地方也可以做，事實上，多半時間是等果蠅交配、出生以及長大，偶爾才看看它們是否有紅眼。

在旅行途中，我得到的攜帶bib轉基因果蠅，以後帶回舊金山，在實驗室進一步實驗證明，bib缺陷的果蠅有神經增加、表皮減少的表型，而通過轉基因導入我所克隆的bib gDNA後，可挽救這一表型，完全證明所克隆的DNA確實就是bib基因。

在低等動物中，我們要求證明拿到一個基因需要分析突變種在一段DNA有缺陷、也可以通過重新導入這段DNA而挽救表型，來證明是否拿到了正確的基因。在人身上，長期做不到這一點。但是，2017年人類基因治療的技術有所突破，可能可以趕上果蠅的研究。

如果要用擬人的方式類比，我當初拿到bib基因的過程其實就像分析人類遺傳疾病，該基因可導致果蠅腦發育異常，我們對其進行分析，獲得DNA序列，確定哪段參與特定腦發育疾病的基因。而後通過轉基因技術導入這段DNA，挽救突變果蠅的腦發育表型，這就是一種基因治療。當然，對人的基因治療一般是體細胞治療，我自己不贊成人類的性細胞基因治療，但支持人類體細胞的基因治療。

製版編輯： 常春藤｜

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