免疫調節劑：胞外核苷和核苷酸

一些抗腫瘤藥物在誘導腫瘤細胞凋亡的同時，可以使細胞表面表達激活機體免疫功能的蛋白分子，從而產生抗腫瘤免疫，這一過程被稱為腫瘤細胞的免疫源性死亡（ICD）。腫瘤細胞釋放的核苷酸（如ATP）對激活抗原提呈細胞、促進抗腫瘤治療發揮關鍵作用。外核苷酸酶催化核苷酸水解成核苷，使胞外核苷酸減少，限制了抗原提呈細胞的招募和激活。腫瘤細胞和調節性T細胞的外核苷酸酶產生的核苷包括腺苷，能夠直接抑制效應T細胞的增殖和激活，誘導免疫抑制。2017年，《Immunological Reviews》上發表題為《Extracellular nucleosides and nucleotides as immunomodulators》的綜述，討論了死亡細胞代謝產物特別是ATP和腺苷在免疫調節中的重要作用，以及通過恢複核苷酸依賴的腫瘤免疫源性進行治療的方法，現介紹如下。

背景

核苷酸是生物體內重要的小分子化合物，其中ATP既是能量代謝的中心，又可作為胞外信號分子。ATP及其衍生物是多種細胞過程的信號分子，如血管舒張、粘膜纖毛清除和免疫調節。生理或化學應激，如機械損傷、質膜損傷、缺氧或細胞毒性製劑作用均能引起胞內核苷酸的釋放，核苷酸可與抗原呈遞細胞（APC）上的P2R家族受體結合促進其趨化、募集以激活免疫應答。細胞應激或死亡時釋放的核苷酸被外核苷酸酶水解成核苷，而核苷與效應T細胞上的P1R受體結合發揮免疫抑制作用。最近發現外核苷酸酶（CD39和CD73）和腺苷P1R受體（A2AR和A2AB）可作為腫瘤免疫治療的靶點。目前認為促進核苷酸的釋放，抑制其水解成核苷可提高臨床抗腫瘤治療的成功率。

細胞死亡方式與免疫

正常情況下，死亡細胞被專門的吞噬細胞所清除，不會引起免疫反應。但在病理條件下可能出現嚴重的自身免疫反應。傳統認為細胞死亡分為凋亡和壞死。凋亡是程序性細胞死亡（RCD），而壞死是病理的非程序性細胞死亡。近年來，這種過於簡單的模式不斷受到質疑。首先，某些物理和化學療法包括蒽環類或奧沙利鉑化療，UV-或γ射線放療等能誘導ICD，將死亡細胞轉換成治療性疫苗。因此，MCA205纖維肉瘤、TC1肺癌或EL4淋巴瘤細胞免疫源性死亡能使同系C57 / BL6小鼠免於被同類腫瘤細胞攻擊。第二，細胞壞死的調節取決於受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）介導的假激酶混交激酶域蛋白（MLKL）的磷酸化，隨後的寡聚化以及最終的膜通透性增加。研究表明壞死缺陷腫瘤細胞的免疫活性低於坏死充分者。這可能部分解釋了壞死缺陷細胞可逃脫免疫監視的原因。

細胞死亡與危險信號

天然免疫系統是抵禦致病感染的第一道防線。免疫細胞上的模式識別受體（PRR）不止識別外源的病原體相關分子模式（PAMP）還包括細胞應激和死亡產生的內源分子。ICD期間死亡細胞釋放的損傷相關模式分子（DAMP）被PRR識別，促進免疫反應的激活。胞外ATP對ICD至關重要。細胞死亡時釋放的ATP與P2RX7和P2RY2嘌呤能受體結合促進APC的招募和激活。ICD期間，釋放的ATP及代謝產物與P2RX7受體相互作用還能促進DC的激活。

ICD特異性標誌首先包括早期細胞表面鈣網蛋白（CALR）的表達。CALR能促進死亡細胞相關抗原的吞噬。其次，ICD期間死亡細胞釋放膜聯蛋白A1（ANXA1）與DC上甲醯肽受體1（FPR1）結合可將APC引向死亡腫瘤細胞。第三，腫瘤細胞自分泌和旁分泌釋放的CXCL10聯合CXCR3能促進T細胞的招募補充。第四，細胞死亡後期釋放的HMGB1能與其他受體（如Toll樣受體）結合以促進免疫應答及I型IFN的合成（圖1）。但單獨PAMP或DAMP都不能激活適應性免疫，除非有尚未引起中樞或外周耐受的微生物或者致癌物新抗原表位存在。

總之，對ICD的適應性免疫取決於新表位抗原與DAMP（包括ATP）免疫佐劑性增加。這種組合治療所誘導的ICD能對腫瘤抗原的產生免疫記憶，不會造成患者複發。

圖1

核苷酸釋放機制

細胞死亡時會釋放核苷酸以促進巨噬細胞趨化、死細胞吞噬和清除。死亡細胞釋放ATP的機制有很多，如囊泡胞吐、經縫隙連接半通道分泌、經泛連接蛋白通道分泌、通過ATP特異性轉運體進行跨膜轉運等。

ICD時經胞吐作用釋放ATP的方式與交感神經末梢釋放乙醯膽鹼類似。研究表明絕大多數細胞囊泡都能釋放ATP，ATP在胞內囊泡中富集，運至細胞質膜，膜融合時將內容物釋放到胞外。胞內ATP釋放的替代機制包括某些ABC轉運體，如ATP結合盒亞家族C成員8（ABCC8）和ATP結合盒亞家族B成員1（ABCB1）等。這些轉運體通過自分泌/旁分泌將核苷酸轉運至胞外。另一機制是通過質膜上的縫隙連接蛋白完成的。通過與鄰近的細胞緊密貼合，形成間隙連接通道進行細胞間的通訊。在病理條件下，細胞上的連接蛋白半通道可轉運ATP分子至胞外。泛連接蛋白與連接蛋白類似，能在質膜上形成電壓門控通道，可允許ATP穿過。凋亡細胞中泛連接蛋白 1（PANX1）的激活介導ATP的釋放，隨後募集吞噬細胞。

ICD期間ATP釋放是一個多步驟的過程。當ICD被激活時，胞內ATP分子從溶酶體到自噬溶酶體腔，隨後經胞吐作用分泌到胞外，期間涉及到溶酶體相關膜蛋白1（LAMP1）及PANX1依賴的易位。細胞質膜上的LAMP1激活Rho相關蛋白、促進含捲曲螺旋的蛋白激酶1（ROCK1）介導的細胞出泡及caspase依賴性泛連接蛋白1（PANX1）門控通道的產生。因此，溶酶體胞吐作用在ICD誘導caspase和PANX1依賴的ATP分泌過程中起關鍵作用（圖2）。但ICD誘導ATP釋放的確切機制目前仍不明確。

圖2

嘌呤能信號中的自噬

自噬是一種細胞應激反應過程。在自噬過程中，溶酶體融合導致溶酶體水解酶對自噬體的降解。因此，自噬再循環是能量依賴性代謝或合成代謝反應的底物的重要來源。可溶性N-乙基馬來醯亞胺-敏感因子附著蛋白受體（SNARE）和囊泡相關聯的膜蛋白7（VAMP7）與自噬體ATP釋放相關。在幾個關鍵調控因子（包括ATG5、ATG7等）水平抑制自噬能夠使ICD或病毒感染細胞停止分泌ATP，還能抑制細胞免疫源性。自噬有利於免疫刺激性ATP的釋放而不是免疫抑制性腺苷的產生，是化療誘導免疫原性所必需的。因此，自噬缺陷的腫瘤小鼠招募單核細胞、巨噬細胞和DC到腫瘤微環境能力受損，缺乏抗腫瘤免疫反應。此時可通過局部注射外核苷酸酶抑製劑使自噬缺陷腫瘤胞外ATP增加，從而將免疫效應細胞重新募集到腫瘤床中。在免疫活性動物中進行這種干預也能重新募集免疫細胞並恢復化療療效。因此，化療誘導的自噬是應激或死細胞免疫源性釋放ATP的必備條件，對引發抗腫瘤免疫十分重要。最近發現禁食或熱量限制等誘導的自噬也能促進免疫源性化療的療效，這與腫瘤微環境中Treg細胞耗竭有關。

總之，自噬保證了細胞應激狀態充足的能量來源，並維持了核苷酸的高度可用性。此外，導致自噬的分子機制與死細胞釋放的ATP之間的關係，也部分解釋了腫瘤細胞自噬與抗腫瘤免疫的聯繫。

核苷酸水解與免疫

細胞死亡時會釋放核苷酸以促進巨噬細胞趨化、死細胞吞噬和清除。死亡細胞釋放ATP的機制有很多，如囊泡胞吐、經縫隙連接半通道分泌、經泛連接蛋白通道分泌、通過ATP特異性轉運體進行跨膜轉運等。

ICD時經胞吐作用釋放ATP的方式與交感神經末梢釋放乙醯膽鹼類似。研究表明絕大多數細胞囊泡都能釋放ATP，ATP在胞內囊泡中富集，運至細胞質膜，膜融合時將內容物釋放到胞外。胞內ATP釋放的替代機制包括某些ABC轉運體，如ATP結合盒亞家族C成員8（ABCC8）和ATP結合盒亞家族B成員1（ABCB1）等。這些轉運體通過自分泌/旁分泌將核苷酸轉運至胞外。另一機制是通過質膜上的縫隙連接蛋白完成的。通過與鄰近的細胞緊密貼合，形成間隙連接通道進行細胞間的通訊。在病理條件下，細胞上的連接蛋白半通道可轉運ATP分子至胞外。泛連接蛋白與連接蛋白類似，能在質膜上形成電壓門控通道，可允許ATP穿過。凋亡細胞中泛連接蛋白 1（PANX1）的激活介導ATP的釋放，隨後募集吞噬細胞。

ICD期間ATP釋放是一個多步驟的過程。當ICD被激活時，胞內ATP分子從溶酶體到自噬溶酶體腔，隨後經胞吐作用分泌到胞外，期間涉及到溶酶體相關膜蛋白1（LAMP1）及PANX1依賴的易位。細胞質膜上的LAMP1激活Rho相關蛋白、促進含捲曲螺旋的蛋白激酶1（ROCK1）介導的細胞出泡及caspase依賴性泛連接蛋白1（PANX1）門控通道的產生。因此，溶酶體胞吐作用在ICD誘導caspase和PANX1依賴的ATP分泌過程中起關鍵作用（圖2）。但ICD誘導ATP釋放的確切機制目前仍不明確。

核苷酸水解與免疫

核苷酸到核苷（如ATP到腺苷）的轉變是需要多種催化酶反應的多步驟過程。三磷酸核苷磷酸水解酶1（CD39）將ATP水解成ADP，進一步水解成AMP。AMP又通過胞外-5"-核苷酸酶（CD73）進一步轉化為免疫抑制性腺苷。研究表明，腫瘤細胞（如白血病，胃癌，膠質瘤，結直腸癌等）CD39表達上調提示預後不良。多種非腫瘤細胞中也表達CD39，如內皮細胞、B細胞、NK細胞、某些T細胞亞群、巨噬細胞和DC。 腫瘤浸潤淋巴細胞（包括Treg和Th17細胞亞型）表達的CD39介導其免疫抑制作用，促進免疫耐受和腫瘤形成。Treg細胞表達的CD39通過抑制NK細胞促進小鼠黑色素瘤模型的肝轉移。自噬缺陷腫瘤細胞過度表達CD39，促進Treg細胞進入腫瘤中。此外，在化療模型中使腫瘤細胞過表達CD39能破壞體內ICD誘導劑誘導的抗腫瘤免疫，降低化療療效。因此，CD39作為限制胞外ATP的關鍵蛋白在免疫抑制過程中發揮關鍵作用（圖3）。

催化腺苷生成的CD73在多種腫瘤細胞中有表達，並與乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腦瘤和白血病的不良預後有關。非腫瘤細胞如Treg、Th17細胞、髓源性抑制細胞（MDSCs）、B細胞、內皮和上皮細胞以及DCs也表達CD73。低氧可直接調控腫瘤細胞和腫瘤微環境中CD73的表達。缺氧時缺氧誘導因子1-α（HIF1A）被活化，與位於CD73啟動子內的應答元件結合併激活其表達。腫瘤微環境中的其他因子，包括IL-1β，IL-6，前列腺素E2（PGE2）和腫瘤生長因子β（TGF- β）也與外核苷酸酶增加有關，但IFN - γ和IL-4會抑制CD73表達。

缺乏編碼CD73基因的小鼠因缺乏免疫抑制性腺苷傳導信號導致免疫監視提高，不易發生自發性腫瘤如遺傳性前列腺癌和化學誘導的纖維肉瘤。外核苷酸酶的異位表達降低了抗癌免疫療效證明了CD73對抗腫瘤免疫的影響。因此，靶向CD73的單克隆抗體能夠抑制某些自發性腫瘤的生長。這種效應可因CD8+ T淋巴細胞的耗竭受抑制。

總之，應激和死亡腫瘤細胞分泌的ATP對抗腫瘤免疫是必不可少的。腫瘤細胞或腫瘤浸潤免疫抑制細胞表達的外核苷酸酶可將ATP轉變為免疫抑制性腺苷。因此，腫瘤細胞外核苷酸酶表達水平升高的腫瘤患者可考慮接受免疫治療。

圖3

嘌呤能信號的治療調節

該調節能力可以從三個方面設計促進腫瘤細胞免疫原性的藥物。首先，ICD誘導劑能誘導過表達CD39和CD73的腫瘤穩定釋放ATP，以刺激免疫應答。因此，用外核苷酸酶抑製劑或單克隆抗體可能增加抗腫瘤治療的免疫原性。其次，抗腫瘤葯本身引起的ATP釋放不足，可通過激活腫瘤的ATP分泌機制來彌補。目前為止，僅有的促ATP分泌劑是自噬誘導劑。 第三，缺乏ATP釋放機制的腫瘤可通過局部注射ATP激動劑來治療。

靶向腫瘤細胞和Treg細胞上CD39的單克隆抗體或三磷酸腺苷酶（Apyrase）抑製劑能提高腫瘤微環境中ATP的濃度，限制腺苷的生成。最近的研究發現，CD73催化AMP水解成腺苷是腫瘤免疫逃逸中起決定性作用的新型免疫檢查點。因此臨床上可能需要多種免疫抑制拮抗劑聯合使用以阻遏引起免疫抑制的多種途徑。

總結

免疫抑制是抗腫瘤藥物的常見副作用，這也是臨床上常規使用的許多治療方案長期療效不佳的原因所在。ICD治療策略是將腫瘤細胞轉變成治療性疫苗。死亡腫瘤細胞釋放的免疫原性DAMP（包括ATP）以及宿主免疫系統對這種DAMP的識別是ICD的必要條件。最近，免疫檢查點阻斷劑（包括靶向PD-1，PD-L1和CTLA-4的抗體）已經進入臨床。並已證實PD-1 / PDL-1阻斷對某些高度免疫原性腫瘤（如黑素瘤和非小細胞肺癌）非常有效。ICD誘導劑和檢查點阻滯劑聯合使用可能會大大增加對免疫檢查點阻滯有效的腫瘤患者比例。

腫瘤細胞釋放ATP效率低或過度降解可能導致免疫監視異常，從而促進免疫逃逸。因此通過增加自噬、選擇性抑制外核苷酸酶活性、阻斷A2AR受體可改善ICD誘導化療的療效。這些措施是否會造成自身免疫反應等副作用還有待探討。目前，有很多自噬誘導劑如mTORC1抑製劑和熱量限制模擬物。靶向外核苷酸酶或腺苷受體的小分子抑製劑和抗體正在研發中，但未來哪些藥物將率先獲得FDA批准取決於進一步的研究結果。

（編譯 王惠惠；審校 繆長虹）

參考文獻：

[1] Kepp O, Loos F, Liu P, et al. Extracellular nucleosides and nucleotides as immunomodulators.[J]. Immunological Reviews, 2017, 280(1):83-92.

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