優化無細胞表達系統-系統萊斯布里奇大學2017 iGEM項目簡介
萊斯布里奇大學2017年iGEM參賽隊伍的基本信息：
iGEM比賽年度：2017年
隊名：Lethbridge
學校：萊斯布里奇大學（University of Lethbridge）
類別（Kind）：大學生（Collegiate）
組別（Section）：研究生組（Overgraduate）
地區：北美
國家：加拿大
領域/板塊（track）：基礎研究進展（Foundational Advance）
萊斯布里奇大學2017年iGEM參賽隊伍的獲獎情況：
單項獎（Award）：
最佳軟體工具提名（Nominated for Best Poster）
最佳綜合社會實踐提名（Nominated for Best Integrated Human Practices）
最佳教育與公眾參與提名（Nominated for Best Education & Public Engagement）
獎牌（Medal）：金獎（Golden Medal）
項目名稱：
Next vivo: Cell-Free Synthetic Biology for the Masses
項目wiki：
http://2017.igem.org/Team:Lethbridge
無細胞系統
無細胞系統包括所有必要的生物機器以在活細胞外生產蛋白質。由於其固有的安全性和簡單性，無細胞系統為合成生物學家提供了一個強大的工具，用於在不受細胞生命限制的情況下工程化新系統。
無細胞系統允許在活細胞外可靠而一致地表達重組蛋白，繞過遺傳調控和細胞雜訊的問題。由於以下原因，這種系統比基於細胞的合成生物學更具優勢：
·耐受通常不利於細胞的毒素的能力
·能夠將所有能源引導至應用程序，增加設計自由度
·減少生物污染的固有特性，因為組分不會複製突變或進化
·在開放環境中輕鬆控制轉錄和翻譯
·易於摻入非天然氨基酸
·調節環境以獲得最佳蛋白質表達的能力
·快速設計-建立測試周期
·熟練使用線性和環形模板DNA
無細胞系統的類型
細胞裂解物
提取物從大腸桿菌（Escherichia coli），兔網織紅細胞，小麥胚芽，昆蟲細胞或人類細胞中分離出來。
優點-細胞裂解物很容易獲得。
缺點-裂解物與一定程度的不確定性有關;組合物是未知的，並且可能存在不需要的因素，例如DNA酶和RNA酶。
純化重組
高度純化和重構的偶聯轉錄和翻譯系統（TX-TL）是市售的。來自New England Biolabs（NEB）的PURExpress系統是由重組元件組成的蛋白質合成系統的一個例子。來源於大腸桿菌的PURExpress系統僅由10個翻譯因子，20個氨醯-tRNA合成酶，7種酶（包括核糖體），4種能量來源，20種氨基酸和tRNA混合物組成。
優點-污染活性降低，無特異性核酸酶活性，重組蛋白因子為組氨酸標籤，並有各種試劑盒（標準PURExpress，Δ核糖體，ΔtRNA和Δ釋放因子試劑盒）。
缺點-不是開源的，不適用於日常消費者，定製僅限於可用的套件。
Next vivo -新的無細胞系統
萊斯布里奇大學團隊的目標是建立一個完全可定製且易於使用的無細胞系統，這種系統本質上安全且用戶友好。為了實現這一目標，他們開發了Next vivo，這是一個標準化的模塊化系統，包含了所有必需的蛋白質生產機器。
項目團隊在BioBrick標準中設計了一個開放源碼的無細胞蛋白質合成部件。Next vivo允許單個用戶組選擇他們想要的系統中的哪些組件，並省去了他們選擇的其他因素。因此，未來的模塊可以輕鬆添加到系統中，創建各種可定製的TX-TL套件。
具體而言，目標是同時過度表達所有TX-TL組分，並彙集得到的細胞裂解物進行共純化，為生產該系統提供了一種簡單的方法。使用他們的方法，tRNA和核糖體將與MS2外殼蛋白/ Ni2 +複合物結合，並且TX-TL蛋白將直接與Ni2 +親和層析樹脂結合。通過這種方式，組件可以批量純化，並可根據需求創建量身定製的無細胞系統。
生物控制
一個模塊化和可訪問的無細胞平台可以開發重新編碼技術，從而創建修改後的密碼子表。 重新編碼的系統無法水平傳輸到生物系統，從而提供固有的生物防護形式並防止意外的環境釋放。 萊斯布里奇大學團隊已經創建了一個密碼子重新分配工具，可以生成重新編碼的序列來支持這種開發。
生物安全性
隨著重新編碼系統的發展，對生物安全性的影響以及目前篩選方法未檢測到的合成化合物的可能性需要進一步的考慮。項目團隊通過提供軟體工具來解決這個問題，以解決可能的濫用這個系統的問題並強調無細胞合成生物學的重要意義。
教育
Next vivo提供了一個有用的學習工具。利用非擴散性的優勢，項目團隊開發了針對艾伯塔省課程量身定製的簡化協議，向新用戶傳授合成生物學的基本概念。
Next vivo的詳細設計
為了確保新系統的實用性，萊斯布里奇大學團隊開發了一種簡化的表達和純化策略，為無細胞合成生物學生產必需的生物機器。他們的系統包括所有38種必需的TX-TL蛋白，23S和16S rRNA，以及每種氨基酸的tRNA，其中tRNA Phe將作為新型純化方法的概念驗證。此外，還包括對tRNA和rRNA純化策略至關重要的MS2外殼蛋白。
標準構建體設計
蛋白質構建體
每個蛋白質構建體由N端或C端的T7啟動子（BBa_I719005），中等核糖體結合位點（RBS）（BBa_B0034），蛋白質編碼序列，絲氨酸甘氨酸接頭和六組氨酸標籤以及雙終止子（BBa_B0015）組成。啟動子，RBS和終止子是標準的BioBrick部分，在註冊庫中有很好的表徵，為項目系統的初始表徵提供了一個很好的起點。每個構建體也被密碼子優化以允許在大腸桿菌中高效表達。
RNA構建體
每種RNA構建體由T7啟動子（BBa_J64997），RNA產物和雙終止子（BBa_B0015）組成。
純化策略
蛋白質純化
用六聚組氨酸殘基標籤表達轉錄和翻譯因子以允許通過鎳瓊脂糖親和層析進行簡單純化。基於文獻中描述的內容，六聚組氨酸標籤是在每個基因的N-或C-末端編碼的。
RNA純化
為了純化RNA，項目團隊利用了之前發布的純化策略，改編自MS2噬菌體。它利用MS2基因組中的RNA髮夾和形成病毒衣殼的MS2外殼蛋白（MS2BP）之間特定的RNA：蛋白質相互作用。MS2BP在其C端表達有六組氨酸標籤。這種改變賦予MS2外殼蛋白雙重結合能力。它對Ni2+以及MS2髮夾具有高親和力。因此，表達MS2髮夾的tRNA和rRNA可以在與六聚組氨酸標記的蛋白質相同的柱中純化。
項目團隊開發了一種基於通用構建體的新型純化系統，其中感興趣的RNA將被轉錄為具有瘢痕和間隔區域，用作寡核苷酸結合位點。DNA寡核苷酸可與此位點結合，產生DNA-RNA雜交體作為RNA酶H裂解的靶標。之後是兩個MS2髮夾，使MS2BP能夠與MS2BP緊密結合進行純化。
整個系統被設計成可以通過鎳瓊脂糖親和色譜法同時純化所有組分！
組分比率
雖然TX-TL系統由38種蛋白質組成，但它需要多種蛋白質的功能。例如，延伸因子（EF-G，EF-Tu和EF-Ts）參與添加每種氨基酸，而釋放因子（RF1，RF2，RF3）僅在翻譯達到終止密碼子時才涉及。如此，相對於釋放因子，TX-TL系統需要更高濃度的延伸因子。總體而言，所有38種TX-TL組分的濃度差異範圍為6μg/ mL至1000μg/ mL。考慮到這一點，項目團隊制定了一些策略，來設計構建體和/或表達策略，以確保每種蛋白質被純化到適當的最終濃度。
Next vivo系統的理想最終設計是使每個TX-TL組分從單個質粒或細菌人工染色體（BAC）表達，所有基因在不同的啟動子和核糖體結合位點組合下。這提出了兩個問題，首先確定使用哪種啟動子：RBS組合需要大量建模，其次創建含有全部38個TX-TL組分的質粒或BAC可能是不可行的。最近的一篇文章表明，從BAC中表達全部38種成分是不可行的，甚至表達3種單獨質粒的成分也很困難。
甚至在之前提到的論文發表之前，項目團隊已經確定每個質粒只有5-6個組分編碼，導致7-8質粒系統。每個質粒上的TX-TL組分將基於相對最終濃度要求和功能作用，此外還處於特定啟動子：RBS組合的控制之下，使得在該質粒上表達的每種蛋白質的相對比率是正確的。將每個質粒分別轉化到大腸桿菌BL21-Gold（DE3）中並表達。這允許表達高濃度TX-TL組分的更多細胞與更低量的表達所需組分的細胞以較低濃度混合。如果每種質粒的正確量的細胞混合在一起，則所得的純化組分應該處於正確的相對濃度。
tRNA
在自然界中，20個標準氨基酸由DNA編碼1-6個獨特的密碼子序列，每個密碼子序列都有一個相應的tRNA分子，稱為tRNA isoacceptors。在項目的系統中，目標是每個氨基酸都有一個相應的tRNA，以降低複雜性並確保每個氨基酸都可以被整合。
從歷史上看，從細胞中分離特異性tRNA isoacceptor達到100％的純度是不可能的。通常，會受到其他tRNA isoacceptors或tRNA對其他氨基酸的污染。體外轉錄tRNA可產生一種純的tRNA異構體，但這些體外轉錄的tRNA缺乏tRNA在細胞中產生的轉錄後修飾。缺乏這些修飾的tRNA可用於翻譯，但效率較低。
在這裡項目團隊設計了一個系統來純化來自細胞裂解物的特定tRNA isoacceptors，確保完整的轉錄後修飾模式。為了測試他們的RNA純化方法，創建了編碼tRNAPhe的構建體;一個理想的tRNA使用場景，因為與其他tRNA分子相比它已被廣泛研究。
一旦將含有過表達的tRNA和MS2BP的細胞裂解物添加到Ni2 +柱中，MS2髮夾將與MS2BP結合，MS2BP然後將以高親和力與Ni2 +結合。與間隔區和瘢痕互補的DNA寡核苷酸將被添加並退火到該區域，導致短的DNA-RNA雜交區域。在寡核苷酸結合之後，將加入RNA酶H. RNA酶H將選擇性切割該DNA-RNA雜合體中的RNA。隨後，具有正確3"末端的tRNAPhe將被釋放到溶液中，從而允許通過從Ni2+柱分離上清液從MS2髮夾和MS2BP分離tRNA。
核糖體
翻譯的核心部分是核糖體。核糖體是由大腸桿菌中的三種rRNA和超過50種蛋白質組成的大型複合物。因此，它在設計簡單的純化策略方面提出了挑戰。
使用TX-TL組件，可以用六組氨酸標籤標記每種蛋白質以分別純化每種蛋白質。使用核糖體，標記每個核糖體蛋白質和rRNA不能確保純化後功能性核糖體將形成。為了減少非功能性核糖體成分的純化，項目團隊利用先前公布的核糖體純化策略，將MS2髮夾整合到rRNA基因中。
一個MS2髮夾插入到23S和16S rRNA基因中，在3D結構中表面暴露且無功能的區域。這允許組氨酸標記的MS2BP結合完全組裝的核糖體的MS2髮夾，使用鎳瓊脂糖親和層析進行一步純化。為了確保能夠純化核糖體的兩個亞基，將MS2髮夾添加到rRNA基因的兩個亞基的基因中。
驗證構建體
為了驗證TX-TL系統的功能並為Next vivo質量控制提供一個措施，設計了一個額外的結構。
該構建體由T7啟動子（BBa_I719005），培養基RBS（BBa_B0034），增強型黃色熒光蛋白（EYFP; BBa_E0030）的編碼序列，隨後是菠菜適體的編碼序列3x FLAG標籤（BBa_T2004）組成和一個雙終結符（BBa_B0015）。整個EYFP編碼序列經密碼子優化以在大腸桿菌中高效表達。為了驗證成功的轉錄，在加入與菠菜適體mRNA結合的熒光團3,5-二氟-4-羥基亞苄基咪唑啉酮（DFHBI）後觀察到綠色熒光。
為了驗證翻譯成功，在EYFP表達後應該觀察到黃色熒光。此外，EYFP C端3x FLAG標籤通過蛋白質印跡提供了另一種蛋白定量方法，並作為任何其他FLAG標籤蛋白表達的內部大小標記對照。
生物控制
雖然Next vivo目前設計用於實驗室使用，但項目團隊也希望設計使其適合在生物防護成為更大問題的實驗室之外使用。為了避免意外污染環境，他們試圖讓Next vivo利用正交密碼子表，要求輸入序列特定於該系統。這將確保如果DNA或RNA輸入信息最終落入環境中，則沒有生物體能夠將信息正確地轉化為功能性蛋白質。同樣，如果翻譯完畢，Next vivo系統中的任何環境DNA污染都會導致無功能的蛋白質。
為了實現這樣的功能，項目的目標是將系統中編碼的每個tRNA的反密碼子序列改變為另一種密碼子。因此，純化後只剩下一個正交的反密碼子tRNA庫，確保純化的Next vivo系統需要一個正交的密碼子輸入序列。此外，在一個質粒上編碼所有tRNA的情況下，可以很容易地創建多個正交tRNA庫[5]。創建正交密碼子表格可以提供一種獨特的生物保護形式，這對生物體來說是不容易實現的。
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