「分飾兩角」 -CPT1A具有琥珀醯轉移酶活性

景傑編者按：

最近，景傑生物和美國Mayo Clinic的 Taro Hitosugi教授合作，在著名的學術期刊CellReports上報道一種新的琥珀醯化轉移酶CPT1A 【1】。依靠景傑生物的琥珀醯化修飾定量蛋白質組學平台，研究人員利用SILAC定量質譜，鑒定了101個潛在的受CPT1A調控琥珀醯化修飾的底物蛋白。和之前SIRT5的靶蛋白主要定位線粒體不同，本研究發現受CPT1A調控的很多蛋白定位於細胞質中，暗示其參與了非線粒體相關的生物過程。

蛋白質賴氨酸側鏈的琥珀醯化修飾最早由芝加哥大學趙英明教授實驗室發現【2】，後續研究表明該修飾廣泛參與體內代謝途徑的調控，具有非常重要的生物學意義【3】。

關於琥珀醯化修飾的調控，目前已經鑒定琥珀醯轉移酶有p300，加上不久前美國安德森癌症中心呂志民、Rice大學陶怡芝和清華大學邢東明教授等在Nature報道的GNAT家族成員KAT2A【4】。KAT2A和酮戊二酸脫氫酶複合體α-KGDH結合，在細胞核內形成複合體，行使其高特異性的琥珀醯轉移酶的活性，提高組蛋白H3K79的琥珀醯化水平，影響基因的表達調控，最終促進腫瘤的生長。

已報道的去琥珀醯化酶的研究有SIRT5：分別由芝加哥大學趙英明教授課題組【5】、康奈爾大學林和寧教授、香港大學郝權教授報道【6】。該酶同時具有去琥珀醯化和去丙二醯化的活性，廣泛參與代謝途徑酶的調控。

景傑生物和北京大學尚永豐院士、俞文華教授合作報道另一個去琥珀醯化酶SIRT7【7】，該酶在表觀遺傳學水平，調控組蛋白的琥珀醯化，進而影響基因組的穩定性。

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關鍵詞：

琥珀醯化、去琥珀醯化、SIRT5、SIRT7、p300、CPT1A/Carnitine Palmitoyltransferase 1A

研究思路與結果:

琥珀醯轉移酶首先需要有CoA結合的能力，作者首先在Swiss-Prot資料庫中篩選到33個具有CoA結合特徵的蛋白，然後在酵母中異源表達進行驗證，目標鎖定在9個候選蛋白，這其中就有CPT家族成員（圖 1）。已知肝臟中蛋白維持比較高的琥珀醯化水平，而CPT1A又是在肝臟中高表達的isoform，因此作者在體外驗證CPT1A琥珀醯轉移酶活性。

圖1. 通過酵母體外篩選體系篩選潛在的賴氨酸琥珀醯轉移酶

在293T細胞中過表達CPT1A會顯著增加胞內蛋白的琥珀醯化水平（圖 2 A），利用景傑公司提供的琥珀醯化SILAC定量蛋白質組學（圖 2B），在CPT1A過表達細胞系中，鑒定到101個琥珀醯化水平顯著增加的蛋白（cutoff>1.5）,其中有近半數的蛋白定位於細胞質中。並且也證明琥珀醯化水平增加並不是琥珀醯輔酶A的含量增加，或去琥珀醯酶依賴的NAD+輔酶降低導致。

圖2. 利用SILAC定量蛋白質組學鑒定到潛在的，受CPT1A琥珀醯化修飾的底物蛋白

乳腺癌細胞系T47D中高表達CPT1A基因，為了研究該基因的功能，作者利用RNAi對該基因進行knockdown。結果表明KO的細胞中，蛋白琥珀醯化水平顯著降低。利用景傑公司提供的琥珀醯化SILAC定量蛋白質組學，在CPT1A-KO的T47D細胞系中，鑒定到156個琥珀醯化水平顯著降低的修飾位點（cutoff>1.3）（圖 3A）。CPT1Ａ H473突變體喪失和醯基輔酶Ａ結合的能力，體外實驗也表明該突變體喪失乙醯化enolase1的能力。隨後的對enolase1鑒定的琥珀醯化位點進行點突變，體外CPT1A體外醯化實驗表明，K80/81和K335位點是琥珀醯化調控enolase1活性的關鍵位點。因此上述研究表明CPT1A通過琥珀醯化修飾對蛋白活性調控的重要角色。

圖3. CPT1A Knockdown的細胞中，鑒定到156個受調控的位點。在眾多底物中，enolase1活性受琥珀醯化修飾的抑制

研究人員利用點突變，尋找CPT1A中隻影響其琥珀醯化活性的關鍵位點。和CPT1A H473A喪失所有醯化活性不同（醯基輔酶A結合的關鍵位點），CPT1A G710E突變體喪失其carnitine palmitoyltransfererase的活性，但是對其琥珀醯化活性影響不大。表明該位點對CPT1A琥珀醯化轉移酶活性而言非常重要（圖 4）。有研究表面谷氨醯胺代謝抑制的乳腺癌細胞中，enolase1的KD會延長細胞生存。作者的研究表明，這和CPT1A琥珀醯化enolase1，抑制其活性有關。暗示琥珀醯化在細胞生存調控中的重要作用。

圖4. CPT1A G710E突變體只喪失其carnitine palmitoyltransfererase的活性，但是對其琥珀醯化活性影響不大

參考文獻：

1.Kiran Kurmi,et al. (2011),Carnitine palmitoyltransferase 1Ahas a lysine succinyltransferase activity.Cell Reports22, 1365–1373.

2. Zhihong Zhang,et al., (2011),Identification of lysine succinylation as a newpost-translational modification.Nat. Chem. Biol. 7, 58-63.

3.Jeongsoon Park,et al., (2013),SIRT5-Mediatedlysinedesuccinylationimpacts diverse metabolic pathways.Mol. Cell. 50, 919-930.

4.Yugang Wang,et al. (2017), KAT2A coupled with the α-KGDH complex acts as a histone H3 succinyltransferase.Nature552, 273-277.

5.Chao Peng,et al., (2011),The first identification of lysine malonylation substrates and its regulatory enzyme.Mol. Cell. Proteomics10,M111.012658.

6. J. Du,et al. (2011),Sirt5 is a NAD-Dependent protein lysine demalonylase and desuccinylase.Science334,806-809.

7. Lei Li,et al. (2016),SIRT7 is a histone desuccinylase that functionally links to chromatin compaction and genome stability.Nat. Communication.

景傑生物通過整合以組學為導向（包括基因蛋白質組學和組蛋白密碼組學）的生物標誌物發現、以生物標誌物為導向的藥物研發、以高質量抗體為基礎的診斷試劑盒開發這三個環節，逐步構建起「疾病精準分層」、「精準藥物研發」、「疾病精準診斷」 三位一體的精準醫療產業化發展的運作鏈條，從而為精準醫療產業化開創出一片廣闊前景, 並開闢出一條可行路徑。

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