關於植物組織培養的小技巧
【作者】王林（東北農業大學，從事植物合成生物學底盤研究，項目獲中科院科創計劃資助）
【責編】盧陽
什麼是PTC
PlantTissueCulture is
a collection of techniques used
tomaintainorgrow
plantcells,tissuesororgans
understerile conditions
on a nutrient culture medium
-Wikipedia
這是維基百科上關於植物組織培養（Plant Tissue Culture, PTC）的定義，其中值得注意的重點在於維持植物組織的生長發育，以及無菌條件的培養。除此以外，定義裡面還強調了PTC是個很廣的概念，其中包含了一系列培養方法和技術，如下圖所示：1）Enbryo Culture，胚細胞培養；2）Organ Culture，植物器官培養；3）Callus Culture，愈傷組織培養；4）Cell Culture，體細胞培養。
作者眼中的PTC
就像我們可以把核酸提取這樣一類分子生物學實驗粗暴地劃分成細胞裂解和核酸純化兩個步驟一樣，作者認為植物組織培養也可以分為兩個核心步驟，野生材料馴化和組織形態建成。這兩個核心步驟看起來複雜，其實只要注意每一步操作的細節，是可以保證成功率的。下面我們就把每個步驟拆解開，簡單分析一下。
野生材料的馴化
很多時候，進行植物組織培養的目的往往是出於對遺傳轉化受體的需要，從而進行不同條件的培養以提取代謝物進行差異分析，出於這樣的前提，實驗者往往只需借鑒文獻里給出的培養條件或者做出特定改動，缺乏的只是植物材料而已。在大量培養植物材料的過程中，無菌培養是十分重要的，是這一類組織培養實驗能否成功的關鍵，集中體現在無菌操作、外植體消毒等一系列與污染作鬥爭的操作上。
野生材料馴化的幾點細節
1. 滅菌
通常，我們需要對使用的培養基、培養皿、鑷子、解剖刀、去離子水和濾紙進行徹底的滅菌。其中，培養基、鑷子、解剖刀、去離子水等液體和金屬器皿通常採用121℃ 20-30min的濕熱滅菌法；玻璃器皿常用180℃ 2h的乾熱滅菌法；而抗生素、激素等不耐高溫的試劑常用過濾滅菌法。
2. 消毒
消毒是指外植體和操作檯面的消毒，目的是在不傷害植物的前提下，抑制和殺死大部分微生物。其中，外植體消毒的方式主要分為表面消毒和侵入消毒兩種，對於操作檯面的消毒通常是指超凈工作台使用前進行的的30min紫外燈消毒和操作過程中的空氣濾過消毒，值得一提的是，在使用超凈台之前用70 % 酒精擦拭檯面會有一定效果。
對於大部分種子、陸生植物的莖葉等，表面消毒足以殺死可能會在組織培養過程中導致污染的微生物，比如使用70 % 乙醇、5 % 過氧化氫，均可以在短時間內有效殺死表面的微生物；但對於一些生長在潮濕陰暗環境中的植物來說，通常有著大量的組織內生菌，而這些內生菌往往不是表面消毒可以殺死的，一些侵入式消毒劑會比較有效，如使用升汞、次氯酸鈉等。
3. 無菌操作
無菌操作即杜絕一切來自操作者的污染或因操作者失誤導致的其他污染，一些常見的操作手法如下：
4. 富內生菌類型的野生材料的馴化
部分野生材料難以實現有效的消毒，即便是兩種消毒方法複合使用也收效甚微，此時應使用試管苗培養的方法，大批量接種培養，經過兩周後篩選未污染的植株再進行擴大培養，此方法可有效馴化野生植株獲得無菌系，是一些苔蘚植物常用這樣的方法。注意，在培養過程中一旦發生污染，整個培養基的植株都應該丟棄。
如果與內生菌的鬥爭過於艱難，可以嘗試使用組織培養抗菌劑PPM，這是一種廣譜的抗菌劑，但是也會對某些植物有著抑制效果，建議在馴化獲得無菌系之後停止使用。
組織形態建成
在有些時候，我們需要對一些從未進行過組織培養的植物進行人工的繁育，以適應實驗需求，那麼我們往往需要自己進行組織形態建成的探究。
正確地改變培養條件，是建成想要的組織形態的一種策略。
首先要說明的是，在更換培養基的時候，需徹底清除殘餘的培養基並將植株剪切或者其他方式進行處理後移到新的培養基上，否則殘餘的培養基將影響植株的狀態。
那麼有哪些培養條件可以進行人為的改變呢？
1. 光照的強度、光質與光照時間；
2. 培養基的無機成分、有機成分，尤其是生長調節劑；
3.培養基的PH值；
4. 培養基的一些添加劑；
5. 培養的溫度、濕度、培養瓶通氣性等。
1. 光照對植物組織的影響
當發生以下問題時，需要考慮光照因素：
誘導營養生長與生殖生長——光質、光周期，遠紅光通常可誘導生殖生長；
組織褐變率高——光強過強、光照時間過長；
葉片黃化或生長速度慢——光照不足。
2. 培養基成分的影響
植物組織培養的培養基通常需要考慮添加以下成分：
3. 培養基PH的影響
培養基PH不適宜可能導致組織褐變和玻璃化，但不同植物對PH的敏感性不同，如苔蘚植物對培養基PH的敏感性較低，而一些單子葉植物則對培養基PH十分敏感。
4. 活性炭、椰奶等添加劑
活性炭可吸收受傷的植物組織產生的酚類，同時保護易降解的植物激素，在容易發生褐變與玻璃化的組織培養馴化過程中，可以嘗試在培養基中加入活性炭，一般1 g/L。
椰奶、洋蔥、土豆泥、香蕉泥、胡蘿蔔汁等添加成分，其化學成分不完全清楚，但往往具有著一定的調節作用，諸如香蕉泥可以穩定PH有利於壯苗、土豆泥可以補充維生素有利於生根等。
5. 培養室的一些環境參數
培養室的環境尤其溫度會對植物培養造成一定的影響，一般植物組織培養可使用23 – 27 ℃的溫度區間。在一定範圍內，濕度、通氣性等條件通常不會對組織造成關鍵性的影響。
6. 特別地，植物生長調節劑在組織培養中的關鍵作用
植物生長調節劑可分為生長素類、細胞分裂素類、赤霉素、特殊調節劑類四種。
生長素類通常可以誘導植物組織生根、生芽，與細胞分裂素類搭配可以使高等植物向生芽、生根和保持愈傷組織狀態生長，而低等的苔蘚植物沒有根莖葉的明顯分化，其形態建成較為複雜。通常，IBA與NAA、IAA造成的效果相似但相對更強，2，4-D造成的效果與另外三種生長素有著顯著不同。細胞分裂素可顯著提高愈傷組織的生長速度，但對低等植物效果不明顯。
特殊調節劑，如酚噻隆、PSK等，具有著強烈的調節效果但機理尚不明確，可在培養基中嘗試添加。
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