與張鋒同一天！女神也上Science：CRISPR變身診斷工具，可檢測HPV

早在2012年8月，Doudna教授與現任Max Planck研究所感染生物學部主任的Emmanuelle Charpentier在Science雜誌上發表了一篇題為「A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity」的重要成果，首次揭示了CRISPR/Cas這一天然免疫系統的基因組編輯功能。

In the genome editing technology known as CRISPR-Cas9, RNA (blue) guides the protein Cas9 (large bumpy structure) to a target site in DNA (red). Cas9 unwinds the DNA double helix and acts as molecular scissors, snipping both strands of DNA.

之後，以CRISPR-Cas9為代表的新型基因編輯技術迅速風靡科研圈，革新了生物醫學研究，加速了疾病成因的探索，並引發了許多潛在的新療法。與此同時，CRISPR家族也不斷擴大，很多「新成員」浮出水面，其中就包括了CRISPR-Cas12a。

關鍵酶——Cas12a

與大家熟知的Cas9酶類似，Cas12a可用於切割目標DNA。該蛋白最初被稱為Cpf1，於2015年由張鋒團隊在一篇題為「Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System」的Cell論文中首次提出。

學界認為，Cas12a是基因切割工具箱的一個重要補充，能夠在Cas9不能作用的位置切割雙鏈DNA；同時，由於Cas12a切割DNA後留下的是不規則的邊緣（ragged edges），這可能使在切割處插入一個新的基因更容易。

不過，Doudna教授的團隊發現，當Cas12a結合併切割了目標雙鏈DNA時，它會在試管中出人意料地對所有的單鏈DNA發動任意切割。

值得慶幸的是，由於細胞中大部分DNA是以雙鏈螺旋的形式存在，因此，這一發現對於Cas12a的基因編輯功能並不一定是個問題。相反，Cas12a對單鏈DNA的這種「任意切割」還給科學家們帶來了驚喜：允許他們將一個單鏈「報告」分子與Cas12a蛋白進行聯用，當Cas12a發現它的目標後，報告分子會產生一種清晰的熒光信號。

圖片來源：Science（DOI: 10.1126/science.aar6245）

快速、簡便的診斷系統——DETECTR

基於這一思路，Doudna教授團隊開發出一種被稱為「DETECTR」（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）的診斷系統，可用於對臨床樣本中的少量DNA進行快速、簡便地即時檢測。相關成果以「CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity」為題發表在Science雜誌上。

Infographic by the Howard Hughes Medical Institute

具體來說，DETECTR是在一個單一反應中添加所有試劑，包括CRISPR-Cas12a和它的嚮導RNA、熒光報告分子以及一種叫做RPA（recombinase polymerase amplification，類似於PCR）的等溫擴增系統。當加熱到體溫時，RPA會快速增加目標DNA的拷貝數，使Cas12a更容易找到並切割它，然後任意切割附近單鏈DNA，從而讓報告分子發出熒光（具體發光機制見上圖）。

基於CRISPR-Cas12a的DETECTR系統能夠分析細胞、血液、唾液、尿液和糞便，以檢測基因突變、癌症和抗生素耐藥性，以及診斷細菌和病毒感染。

研究中，科學家們利用包含人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的患者樣本對DETECTR進行了測試。結果顯示，利用DETECTR，他們能夠在感染多種不同HPV類型的樣本中準確測定出高風險的HPV 類型：HPV16和HPV18。

論文的共同第一作者Janice S. Chen認為，Cas12a可作為一種強有力的工具，用於從各種各樣的來源中檢測DNA。DETECTR這項技術可能適用於任何基於DNA檢測的即時診斷情況，包括癌症和傳染病。

再次驗證CRISPR酶的檢測功能

事實上，Cas12a與CRISPR酶家族的另一個蛋白Cas13a活性類似。也正是利用後者，張鋒團隊在同日發表在Science論文中提出了升級版的診斷工具SHERLOCK。詳細閱讀《張鋒最新Science！CRISPR新功能升級，可用於腫瘤DNA等多種核酸檢測》一文。

Cas13a於2016年6月由張鋒團隊首次發現；3個月後，女神研究組就證實了該酶的「collateral cleavage」活性（Cas13a在切割了它的意向RNA目標後依然能夠保持「活躍」，繼續爆發性式地切割其他非目標RNA）可用於RNA檢測。不多久（2017年4月），張鋒團隊也開發出了基於Cas13a的初級版SHERLOCK。兩大陣營在這一研究方向的競爭可謂非常激烈。

Doudna教授說：「現在，我們仍著迷於細菌CRISPR系統的功能，以及如何藉助對相關機制的理解來產生新的技術。」

此次，雙方於同日在Science發表新成果，不管是雜誌刻意安排，還是一種巧合，都再次證實了CRISPR酶用於核酸檢測的實力。或許，除了基因編輯，CRISPR還能帶給我們帶來更多、更大的驚喜！

參考資料：

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