利用CRISPR/Cas9為DNA照相，新型細胞記錄儀捕獲DNA數據

圖：基於CRISPR的記錄儀可以清晰記錄細胞事件 來源Russell Kightley/Science

飛機的飛行記錄儀和照相機可以幫助調查人員理解複雜的事件，尋找真相。在科學研究領域，細胞生物學家也在試圖建立他們自己的數據記錄儀器，例如通過將目的基因與熒光蛋白基因聯繫起來，我們就可以了解闡明諸如癌症出現、衰老、環境影響和胚胎髮育等過程。具有革命性基因編輯工具CRISPR的出現，為新型細胞記錄儀提供了更好的記錄手段，新型細胞記錄儀藉助CRISPR可以捕獲DNA數據。

David Liu

近日，Science在線發表了一項CRISPR新研究成果，哈佛大學化學家David Liu和Weixin Tang博士展示了兩種CRISPR介導的模擬多事件記錄儀——CAMERA系統。在驗證實驗中，研究人員利用該系統成功記錄了細菌和人類細胞對光照、抗生素、病毒感染等多種刺激的反應以及Wnt信號變化。

研究人員提出了兩種CRISPR介導的模擬多事件記錄裝置（CAMERA）系統，利用鹼基編輯器和Cas9核酸酶記錄細菌和哺乳動物細胞中的細胞事件。前者能特異性的識別DNA序列，而後者負責剪切識別位點。該系統使用CAMERA 1記錄信號振幅或持續時間顯示互斥DNA序列的比率變化，CAMERA 2則通過記錄信號振幅或持續時間展示單鹼基修飾變化。在驗證實驗中，給予刺激的順序可以通過重疊的指導RNA設計進行記錄，並且記錄可以在多個循環中被擦除和重新錄入。此外，當記錄多拷貝質粒信息時，只需要10-100個細胞就可以得到可靠的數據。

加州大學伯克利分校的蛋白質工程師Dave Savage表示，這項研究的創新之處在於利用CRISPR發現細胞分子途徑，是一種非常有創造性的方法。

眾所周知，CRISPR的初始作用為定位並切割雙螺旋DNA，廣泛用於基因敲除與基因編輯。但是在CRISPR切割的過程中，它們可以向目標基因引入隨機錯誤，使其失效。有幾個研究團隊已經將這些隨機誤差當作標記（或條形碼），來跟蹤細胞如何從一種狀態到另一種狀態。而「CAMERA」的機制則是利用外來信號對CRISPR系統的刺激作用，記錄這種作用引起的遺傳信息改變，通過記錄遺傳變化就能夠了解細胞受到的刺激。

David Liu表示，為尋求更清晰的信息記錄，CAMERA不僅要記錄一個細胞是否經歷過刺激，而且還記錄刺激強度以及持續時間，我們希望能夠看到某些細胞是執行還是忽略某些信號來停止生長，這有助於更好地了解癌症的發生。

CAMERA的第一種形式利用了質粒自我複製但嚴格保持一定的種群數目的特性。該形式包含了兩種質粒R1和R2，兩者初始比例是穩定的。記錄儀還含有一種特殊的質粒，該質粒被引入了含有 CRISPR 組分的基因，當細胞受到外來刺激時，能激活該質粒，並在細胞內轉錄或翻譯出嚮導RNA和Cas9 酶，作用於R1質粒，使其數目發生變化。例如，在研究者們進行的一項測試中，當他們把一抗生素激活的CAMERA系統裝於細菌中，通過測序細菌並記錄 R1:R2 的變化，研究者們便能夠知道細胞暴露於藥物的時長。

CAMERA的第二種形式則使用了修飾過的 Cas9 酶，該酶不能切割雙鏈DNA，但卻能作用於胞嘧啶使其轉化為胸腺嘧啶。當CRISPR系統被激活時，嚮導RNA 把Cas9酶定位至「安全港」的基因，這類基因能夠被任意改變而不損害細胞。研究者們能通過觀察「安全港」基因胞嘧啶的改變情況，間接記錄信號作用的強度。例如，在另一項測試中，研究者們通過激活 Wnt 通路（該通路在胚胎髮育和癌症發生中發揮著重要的作用），使 CAMERA 開啟，以記錄刺激信號對Wnt通路的作用。

事實上，David Liu並不是第一個利用CRISPR創建記錄儀的研究者，在此之前，已有部分科學家進行了相關研究，其中包括劍橋麻省理工學院的Timothy Lu。但Lu指出，他研究設計的系統mSCRIBE作為模擬記錄裝置，可記錄生物事件的持續時間或幅度信息，但這僅限於細菌，與CAMERA相比，它還需要「一個數量級」的更多的細胞才能獲取、記錄可靠地信號，並且信噪比較差。 而CAMERA 能夠利用僅包含10個細胞的樣本工作，其意義至關重大。因為所需細胞越少，代表著測量精確度也越高。他表示，David Liu的這項新研究「非常美麗」，並且效率和精度水平超出了我們以前的水平。

哈佛大學遺傳學家 George Church指出，如果想要繪製一幅大腦活動圖，每一個細胞都不同且至關重要。同時，CAMERA的另一個重要意義在於，它能夠記錄信號作用的時間與強度。以癌症為例，這能幫助我們觀測癌細胞在不同階段對不同信號的響應情況，以闡明其增殖機理。Church 表示：「理想情況是有一個單分子自動記錄儀，能記錄可讀的DNA序列，並告訴我們在每段時間內每個細胞在發生著什麼。」

此外，CAMERA 還有其他潛在的功能，例如清除已記錄的信息、通過藥物「重置」質粒比等。CAMERA 還可以同時或先後記錄幾個不同的信號對細胞的作用。但是 CAMERA想要 證明自己的價值，研究人員必須要證明它能夠在動物體內也發揮作用，而不只是在體外細胞實驗中。

參考文獻：

Genome editor CRISPR』s latest trick? Offering a sharper snapshot of activity inside the cell

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