探尋「生命樹」之根—人類胎盤滋養層幹細胞的建系歷程與其意義

在「生命樹之謎」第一期，小編已經帶領大家從整體上認識了胎盤這一哺乳動物妊娠期間特有的臨時性器官。胎盤中各滋養層細胞在介導母胎之間物質交換、激素和因子分泌以及妊娠適應性調節等方面起到重要作用。從發育的角度看，各種滋養層細胞都來自於共同的祖先--滋養層幹細胞（Trophoblast Stem Cells,TSCs）。此外，TSCs是胎盤發育和功能研究的理想體外模型，其分離培養和建系一直是生殖生物學和生殖醫學領域的重要方向之一。

目前某些物種的TSCs已成功建系，如小鼠和兔，而有蹄類和人類TSCs的建系卻一直未能成功。對小鼠這一模式生物的滋養層幹細胞的研究最為深入，其體外分離培養和誘導分化體系已經非常完善。Rossant實驗室在1998年首次從小鼠E3.5天囊胚和E6.5天早期胚胎的胚外外胚層（Extra-embryonic Ectoderm, ExE）中成功分離並建立了穩定的小鼠滋養層幹細胞系（mTSCs）。在成纖維細胞生長因子4（FGF4）和轉化生長因子β1（TGF-β1）/Activin存在下，mTSCs可以無限制自我更新並保持分化成各種滋養層細胞的能力。可以說，mTSCs是目前研究小鼠滋養層細胞分化和功能調節機制的理想體外模型。許多轉錄因子，包括Cdx2、Eomes、Elf5、Esrrb和Gata3已被證實是維持mTSCs未分化狀態的關鍵因子。在不同的培養條件下，mTSCs幾乎可以被誘導分化成所有類型的滋養層細胞亞型，例如合體滋養層細胞、海綿滋養層細胞和位於母胎界面的各種滋養層巨細胞。

儘管科學家們付出了長期而艱辛的努力，人類TSCs的建系工作依然進展緩慢，直到2018年1月，即小鼠TSCs成功建系20年之後，Cell Stem Cell報道了日本科學家Okae的工作，宣告了人類TSCs建系的重大突破。

那麼本期小編就先帶領大家重點複習一下人類TSCs的研究進展吧。

人類TSCs的艱辛研究歷程

由於倫理道德限制，用高質量的人類早期胚胎開展TSCs的研究受到很大的制約，而從妊娠早期絨毛或者足月胎盤中分離出的滋養層細胞大多已定向分化，這使得人類滋養層幹細胞的研究遠遠落後於小鼠。長久以來，某些細胞系作為人類滋養層細胞的體外研究模型，包括絨毛膜癌細胞系、轉化或永生化的細胞系、BMP4誘導分化的人類胚胎幹細胞等。這些細胞系都存在一些問題，在形態、標誌分子或基因表達譜上與原代滋養層細胞有差異，因而不能全面而真實地反映人類滋養層細胞的功能。最近Genbacev等和Zdravkovic等分別從絨毛膜和人類胚胎幹細胞系UCSFB6中分離出人類滋養層祖細胞系（TBPC）和類滋養層幹細胞。但在添加FGF、FBS和TGF-β抑製劑SB431542的條件下，TBPC仍不能維持多能幹性，很快分化為合體滋養層細胞和侵襲性滋養層細胞。此外，儘管TBPC和UCSFB6來源的類滋養層幹細胞能夠表達多種滋養層標誌分子，但其形態上類似於間質細胞。

人類TSCs的成功獲取

2018年初，由日本科學家Okae等首次成功地從囊胚滋養外胚層和早孕胎盤細胞滋養層細胞中獲得人類TSCs，並分別命名為TSblast和TSCT（圖1）。這註定是生殖生物學和生殖醫學領域中一個里程碑式的事件。

圖1.人類滋養層幹細胞的來源

那麼，作者是如何找到相關信號通路並據此分離培養出人類TSCs的呢？又是如何驗證其特性和功能的呢？接下來小編就帶你了解一下這篇文章的精彩之處。

1

從CT細胞中誘導出滋養層幹細胞

首先，作者基於RNA-seq數據，分析了早孕胎盤中細胞滋養層細胞（Cytotrophoblast,CT）、絨毛外細胞滋養層細胞（Extravillous Cytotrophoblast,EVT）和合體滋養層細胞（Syncytiotrophoblast,ST)的原代細胞的表達譜，其中CT細胞中高表達Wnt和EGF信號通路以及毛囊發育相關通路，而這些對於多種上皮幹細胞的增殖是必須的。因此，作者認為CT細胞在類似的上皮幹細胞培養條件下，也能夠培養出具有增殖能力的乾性細胞。基於此，他們在培養基中施加了多種與上皮幹細胞體外培養相關的抑製劑和生長因子，並通過多組實驗（圖2.A）最終確定CHIR99021、EGF、A38+SB431542(TGF-β抑製劑)、valproic acid(VPA)(組蛋白去乙醯化酶[HDAC]抑製劑)和Y27632（Rho相關蛋白激酶[ROCK]抑製劑）的施加能夠有效的培養出增殖性CT細胞（圖2.B）。在誘導出這種增殖性CT細胞後，作者又進行了形態和標誌分子上的鑒定，並將其認定為CT源的TS細胞（TSCT細胞）。

圖2.增殖性CT細胞的體外培養

接下來，作者又進行了一系列功能上的研究，以確定該細胞系就是具有TS細胞功能的細胞系。

2

TSCT細胞能分化成EVT樣和ST樣的細胞

作者基於前人的研究和實驗發現，在含有NRG1、A83-01和Matrigel的培養體系下（圖3），TSCT細胞能成功誘導分化成高表達HLA-G的EVT-樣細胞，並進行了標誌分子鑒定（圖4），並命名成EVT-TSCT細胞。

圖3.TS

CT細胞定向分化方案

之後，作者在添加forskolin的培養基中培養TSCT細胞（圖3），發現細胞能夠聚集並有效的融合形成大的合體細胞。同時，形成的細胞也高表達ST細胞標誌分子（圖4）。作者將這類細胞命名為ST(2D)-TSCT細胞。此外，因為McConkey等人之前在3D培養條件下發現，3D培養能增強絨毛膜癌細胞向ST樣細胞分化。因此，作者也同樣進行了3D培養，並額外加入EGF（圖3），發現能形成表達ST細胞標誌分子（圖4），並大量分泌人絨毛膜促性腺激素（hCG）的細胞，因此，作者將這類細胞命名為ST(3D)-TSCT細胞。

圖4.TS

CT, EVT-TSCT和ST(2D)-TSCT細胞的鑒定

3

從囊胚中誘導出滋養層幹細胞

除了從CT細胞誘導獲得TS細胞，作者利用相同的誘導培養條件，從囊胚中也成功誘導出滋養層幹細胞，並命名為囊胚源的TS細胞（TSblast）。此外，與TSCT細胞相同，TSblast也能夠分化成EVT-TSblast、ST（2D）-TSblast、（3D）-TSblast。

除了形態、標誌分子以及功能上的鑒定，作者還分別從轉錄組、DNA甲基化模式以及體內功能上進行了更詳細的驗證，讓我們跟著作者的思路繼續看。

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人滋養層幹細胞轉錄組分析

為了確定TSCT和TSblast是否具有與原代滋養層細胞相似的基因表達模式，作者分別對TSCT、TSblast和誘導分化的細胞進行轉錄組測序（RNA-seq）分析。結果顯示：TSCT和TSblast之間基因表達模式非常相似（R>0.98）。而且，由TSCT和TSblast體外分化來的EVT-和ST-樣的細胞的基因表達模式與原代EVT和ST細胞也非常相近（圖5）。

圖5.差異基因表達分析

5

人滋養層幹細胞DNA甲基化模式分析

滋養層細胞的DNA上具PMDs區（large partially methylated domains）、胎盤特異性啟動子低甲基化區和gDMRs區（germline differentially methylated regions）。為了驗證這些獨特的甲基化模式是否在TSCT和TSblast細胞中保留下來，作者分別進行了相關驗證。

首先，作者分別對TSCT和TSblast細胞做了全基因組重亞硫酸鹽測序（whole-genome bisulfite sequencing, WGBS），並與先前已經報道的CT細胞、人胚胎幹細胞（hESCs）以及臍帶血細胞的測序數據進行比對（圖6）。結果表明胎盤特異性DNA甲基化模式在TSCT和TSblast細胞中最大化的保留下來。

圖6. TS

CT和TSblast細胞PMDs分析

其次，作者又對包括Elf5在內的55個在滋養層細胞中甲基化水平較低啟動子區域的甲基化水平進行分析，結果表明胎盤特異性啟動子低甲基化區在TSCT和TSblast細胞中的甲基化水平也維持在較低水平（圖7）。

圖7.TS

CT和TSblast細胞啟動子區甲基化分析

最後，研究發現在CT、TSCT和TSblast細胞中大多數gDMRs都維持在中等甲基化水平（30%-70%）。在TSCT細胞系中又分析了等位基因-特異的DNA甲基化水平，發現所分析的十個等位基因中有九個維持著母源等位基因特異的DNA甲基化水平（圖8）。其中19號染色體微小RNA簇（C19MC）是人類胎盤中一個重要的印記調控區域。作者分別對CT、TSCT和TSblast細胞作了miRNA測序發現C19MC miRNAs各個成員均高表達於CT、TSCT和TSblast細胞，而在其它細胞中表達較弱。

圖8.TSCT細胞gDMRs分析

上述結果都表明，其體外分離培養的人類滋養層幹細胞的甲基化模式並未發生較大變化，基本符合胎盤甲基化特徵。

6

人滋養層幹細胞體內功能驗證

為了驗證TSCT和TSblast細胞在體內是否具有功能，作者嘗試將TSCT或TSblast細胞皮下注射到非肥胖型糖尿病-重症聯合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠體內。對所產生的損傷部位進行切片染色分析發現，這些細胞在一定程度上發生了分化並侵潤遷移到真皮和皮下組織中。此外，還在宿主小鼠血清中檢測到大量人絨毛膜促性腺激素（hCG）（圖9）。這在一定程度上證明這類TS細胞在體內具有分化能力，並模擬了胚胎植入期，早期滋養層細胞的侵潤特性。

圖9.TS

CT和TSblast細胞皮下注射NOD-SCID小鼠

總結與展望

小編認為這篇文章的重大突破在於通過RNA-seq數據的系統分析精確挖掘了TSCs乾性維持的信號，因而能夠精準地實現從CT細胞和囊胚中穩定分離TSCs。相信這一工作將會極大地推進人類滋養層細胞譜系分化和功能單元構建相關研究。

從結構上來看，人類和小鼠的胎盤都屬於血絨胎盤，而且功能上也有很多相似之處，甚至很多妊娠相關的生理和病理過程的研究都是基於小鼠胎盤模型開展的，但是在胎盤發育早期，兩者之間有很大不同，作者也對此做出了論述。首先，TGF-β和Wnt信號通路在人和小鼠TS細胞內可能起著不同的角色。作者發現若成功獲取人的TSCT和TSblast細胞，需要激活Wnt和EGF信號通路，同時抑制TGF-β、HDAC和ROCK信號通路。而分離小鼠TS細胞，則需要激活FGF和TGF-β信號通路，抑制Wnt和ROCK信號通路。其次，FGFR2c和FGF4對於小鼠TS細胞維持必不可少，但在人的CT、TSCT和TSblast細胞中FGFR2c的表達量可以忽略不計。因此，FGFR2c-介導的FGF信號通路在人類滋養層細胞的增殖過程中可能作用不大。此外，作者還發現很多控制小鼠TS細胞自我更新的關鍵轉錄因子，包括Cdx2、Eomes、Esrrb和Sox2，在人的CT、TSCT和TSblast細胞中表達量很低。

最後，小編認為如何利用人類TSCs體外誘導分化模型來鑒定各滋養層細胞亞型是今後研究的重點。作者也提到由於目前還沒有太多能夠分辨各種EVT亞型的分子標記，本文並未將TSCs所分化成的EVT亞型進行詳細的鑒定。除此之外，作者還談到TSCT細胞的來源問題。先前有文章報道在人類胎盤中存在3種CT細胞亞群：ST祖細胞、EVT祖細胞和雙潛能細胞，作者推測TSCT細胞可能來源於這類雙潛能細胞。因為妊娠早期，CT細胞能夠產生新的絨毛，表明該處具有幹細胞特性的CT細胞。同時在滋養層細胞柱近端的CT細胞具有高增殖能力而且是EVT的來源，所以作者認為這些細胞中可能包含了雙潛能幹細胞。因此，作者認為未來可以研究CT細胞的亞型以及他們的標誌分子，從而精準確定TSCT細胞的來源。當然，隨著單細胞測序技術的發展和普及，小編確信更精準地分析TSCT細胞的來源是完全可以實現的。

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責任編輯：邊曉濤 蔚欣

生命樹之謎：

中國科學院動物研究所生殖病理學研究組

BOSS簡介：

http://sourcedb.ioz.cas.cn/zw/zjrc/200907/t20090716_2088415.html

Lab簡介：

http://rpb.ioz.cas.cn/yjz/wangyanling/

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