Nature重磅！CRISPR再迎技術革新！xCas9可有效提高CRISPR效用！

新聞 03-05

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導讀

CRISPR是生物科學領域的遊戲規則改變者，這種突破性的技術通過一種名叫Cas9的特殊編程的酶來發現、切除並取代DNA的特定部分。問世以來，CRISPR-Cas9已成為生物實驗的關鍵工具。該技術相較於過往的編輯工具可以更加迅速便捷地對基因組的特定位點進行編輯，相應的，其局限性也困擾著研究人員。

哈佛大學的化學生物學家David Liu領導的研究團隊設計出一種稱為xCas9新酶，可更多更有效地修改基因組中的位點，進而提高CRISPR-Cas9的效用，同時還可降低脫靶風險。這項研究結果以《Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity》為題發表在2月28日的《Nature》上。

CRISPR靶向特異性是由兩部分決定的，一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的鹼基配對能力，另一部分是Cas9蛋白對靶DNA的3"末端發現的被稱為protospacer adjacent motif（PAM）的DNA序列上的識別能力。

PAM通常由NGG三個鹼基構成（N為任意鹼基）。

病毒入侵時，Cas1和Cas2編碼的蛋白將掃描這段外源DNA，並識別出PAM區域，然後將臨近PAM的DNA序列作為候選的原間隔序列。

隨後，Cas1/2蛋白複合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來，並在其他酶的協助下將原間隔序列插入臨近CRISPR序列前導區的下游。不同的Cas9的識別能力不同。

目前，最常用的實驗Cas9是從化膿性鏈球菌中分離而來，稱為spCas9，其在具有32億個鹼基對的人基因組中，大約僅能正確識別其中的1/16序列。這就是CRISPR-Cas9技術的真正局限性。

Liu及其研究團隊對spCas9稍加改動，迫使spCas9在實驗室中迅速擴增，積累突變，再識別各種PAM序列並對臨近的DNA進行切割。他們最終獲得了xCas9，其可更廣泛地識別不同的PAM，從而使得Cas9的識別能力增加了至少4倍。

研究人員對該酶進行了測試，並將其與鹼基編輯器組合，他們發現，改變後的xCas9的不僅提高了CRISPR-Cas9的效用，而且切割能力未受影響，甚至降低了脫靶風險，成功實現了雙贏。

連續進化的Cas9具有更寬的PAM兼容性

演變後的xCas9在人細胞中的轉錄激活和基因組DNA切割

另一方面，加利福尼亞大學聖地亞哥分校的生物工程師Prashant Mali說，同樣的方法可以用來改變Cas9酶的其他變體，包括一些有希望用於基因治療的相對較小的Cas9蛋白質。他說，那些蛋白質往往具有更為嚴格的限制性PAM序列，若能成功應用這項技術，對基因治療將是莫大福音！

加利福尼亞斯坦福大學的合成生物學家 Stanley Qi 稱這項工作「令人眼花繚亂」，並表示他的團隊渴望在實驗中應用此項成果。xCas9具有更廣泛的PAM識別和更高的特異性，這足夠令科學家們興奮，但是，在徹底挖掘出這項技術的潛力前，仍需要進行更多的測試。

參考文獻：

1.Powerful enzyme could make CRISPR gene-editing more versatile

2.Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity

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