中外合作Nature報道成年以後神經元不能產生了

BioArt按：到目前為止，關於成年之後神經發生在靈長類的皮層和海馬是否存在一直存在爭議。半個世紀以來，不同的科學家使用不用的實驗方法得出了不一樣的結論。然而剛剛在線的一篇由UCSF的Arturo Alvaez Buylla實驗室、復旦大學腦科學研究院楊振剛實驗室和西班牙巴倫西亞大學(Universidad de Valencia)Jose Manuel Garcia-Verdugo實驗室合作完成的Nature論文表明人的海馬在成年之後也不會有神經發生，對成年之後神經發生作為可塑性一種的理論提出了否定性證據。同期Nature發布的新聞與觀點評述文章中也對該工作進行了評論。為了讓讀者朋友全面了解圍繞成年後神經發生這一重大科學問題的相關爭議和整個學術研究歷程，BioArt特別邀請到了神經生物學白可豪博士撰文詳述，以饗讀者！

撰文丨白可豪

關於大腦的重要性已經在多個場合被提及，作為本文的開始，我想已經不用再過多的提起。 然而大腦功能令人著迷的一個地方在於，出生之後大體結構已經構建完畢的器官如何應對不可預測的，多樣性的環境，併產生可靠而又牢固的經驗，指導有機體進一步學習和應對新的挑戰。現在我們已經知道大腦可以通過不止一種機制來應付這些挑戰， 比如LTP/LTD， 突觸的發生和消減等等。在眾多可備使用的機理中，產生新的神經元來處理新的信息這一假說則經歷了反覆論證，百家爭鳴，至今仍然無法給出一個確切的結論。

讓我們首先回到從前。在繪製出分子生物學基本藍圖之後， 許多科學家開始將注意力轉移到基因如何通過影響神經系統的結果影響行為。為此據說專門組織了一個會議，討論選擇何種模式生物為突破口了解大腦的功能， 這個會議的參與者當時基本囊括了後來神經科學裡的領軍人物。 會議的結果是Sydney Brenner選擇了線蟲，Seymour Benzer選擇了果蠅，Eric Kandel選擇了海兔，而Richard Sidman選擇了小鼠。 在這裡面，前面三個名字對於所有學習神經科學的研究生來說大概耳熟能詳， 最後一個則顯得有些陌生， 原因大概也與當時利用小鼠得到的數據不能夠像前面三位那樣系統而詳實不無關係。 其實Richard Siman在1960年代已經培養了許多具有突變表型的小鼠【1】，也mapping出其中一些小鼠基因突變可能的位點。 然而受到當時技術條件以及小鼠本身的限制，這些小鼠無法回答神經發育的基本過程， 因此Richard Sidman無法向果蠅以及線蟲里的同事一樣快速鑒定基因如何影響神經發育。可見在科學研究的過程中選擇一個好的研究對象對於快速回答一些重要的科學問題也是至關重要的。

除了合適的研究對象外，一個好的方法和途徑(Approach)往往也能推動一個領域的發展，這一點在神經科學則尤為明顯。1950年代開發的3H標記的胸腺嘧啶就是一個例子。它的廣泛使用極大的促進了對神經發生(Neurogenesis)的研究。因為新的細胞類型產生多數要通過細胞分裂之後進而通過命運決定而完成。 這個過程需要合成DNA，因此動物體內給予的3H標記的胸腺嘧啶就可以插入新產生的細胞的DNA，使得細胞可以通過放射顯影被標記出來(此處可聯想DNA半保留複製中的同位素標記實驗， 以及蛋白質運輸過程中的pulse chase實驗)。 而如果一個新產生的細胞分化為神經元的話，那麼這些被標記的胸腺嘧啶則因為神經元的不可分裂的特性而留在了該神經元的細胞核里。利用這一特性，Richard Sidman 和當時參會的另一位科學家，現為耶魯大學教授的Pasko Rakic分別向小鼠和恆河猴體內注射這種被標記的胸腺嘧啶， 分別在不同的時間點觀察被標記的細胞，得到了現在寫進教科書里的」後來居上「的遷移模式【2,3】。

既然能夠標記發育時期的神經元， 那理論上也應該能標記成年狀態下產生的神經元， 如果有的話。這樣一來就可以直接回到成年之後大腦是否可以利用產生新的神經元的方式處理日漸增多的信息。為此Pasko Rakic在成年的猴子體內進行了這樣一個實驗， 並於1985年在Science中宣稱在恆河猴的皮層在出生之後不再有神經發生【4】，這似乎表明在靈長類的大腦皮層，神經發育的藍圖在出生之前也已完成，後天對環境的適應和改造似乎是在神經系統的其他與神經發生不相關的層面上進行。其實早在研究胚胎時期的神經發育的時候Pasko就發現猴子在出生之後皮層內產生的新的神經元幾乎可以忽略。因此這一成年的發現也是他前期發現的一個補充。 這些似乎表明在非人靈長類，神經發生在理解大腦功能和治療疾病上並非首選。

那麼這樣一個發現與前人的結論相比如何呢? 事實上關於成年之後的神經發生現象並非很晚才被關注。 現代神經科學之父西班牙科學家Cajal在經過長期而細緻的觀察並結合其他組織學家的發現，認為包括人在內的許多動物的大腦皮層在成年之後沒有神經發生的現象【5】。在此之前，1958年加拿大McGill的B.Meisser等通過向新成年小鼠(13g) 皮下注射的方式， 觀察到在大腦皮層被標記的細胞。因此推測在大腦皮層基本結構發育完成之後，仍然存在著產生新的細胞的能力，但不能確定是否為神經元【6】。1961又對完全成年的小鼠(26-28g) 進行皮下注射， 發現在亞腦室區仍然能夠觀察到大量被標記的細胞，但是在皮層卻未能觀察到被標記的細胞【7】。1960年Brigitte Schultze 和 Wolfgang Oehlert通過在大鼠腹腔注射3H-T，並未在中樞神經系統發現被標記的神經元【8】。以上這些實驗似乎更進一步證實了這樣一個結論: 大腦內神經元的數目在出生之前就已恆定，大腦不會通過增加神經元的方式應對環境和修復損傷。

爭論:

「一些人認為Altman應該因為這個發現得諾貝爾獎， 不過他在2016他去世了」

然而這樣的結論被來自MIT的Joeseph Altman否定了。Altman是一位猶太人，經歷磨難移民到美國，通過自學而得到在紐約大學進行研究生學習的機會。後來在MIT作為獨立的研究博士後期間，他的工作在成年神經發生領域攪起了一陣波瀾。讓我們簡單的過一遍他在1960年代的幾篇代表性論文：

1962年Joeseph Altman 在Science發文稱通過顱內注射(intracranial injection)H3標記的胸腺嘧啶，在成年大鼠的皮層發現了被標記的神經元【9】。

1963年Joeseph Altman 在Anatomy Record發表論文稱通過給新成年 (Young Adult)大鼠腹腔注射或者給成年的貓通過腦室注射3H-T均能夠在皮層觀察到被標記的椎體細胞，在海馬觀察到被標記的顆粒細胞；在成年貓的皮層看到被標記的神經元【10】。

1965年 Joeseph Altman對經過連續接受腹腔注射的成年大鼠 (4 months) 進一步分析，發現在海馬能夠被標記的顆粒細胞數目隨大鼠年齡增加而減少， 且這一過程伴隨海馬體內業已分化的顆粒細胞數的增多。 這一結果提示神經發生的潛力隨年齡增大而降低【11】。

1967年Joeseph Altman 在新生或6天大的豚鼠進行實驗證實在出生後豚鼠的海馬和小腦能夠標記新生的顆粒細胞。因為豚鼠出生之後可以行走，因此大腦在新生階段較大鼠和小鼠更為成熟，因此提示新形成的神經細胞可能對應於後面學習之後的行為控制【12】。

可以說Altman的這幾項研究似乎表明成年嚙齒類的神經發生是一個廣泛存在的現象，如果這一現象屬實將無疑具有開創一個新的領域的價值。然而，儘管Altman在Nature和Science上報道了他驚世駭俗的發現，他還是沒能進入MIT的tenure track系統，後來轉到普度大學進行利用有限的經費繼續他的研究。而這些研究的結論也因為不能排除一些其他因素的干擾， 沒有被學術界廣泛接受。後來嚙齒類海馬、嗅球等腦區的成年神經發生被廣泛研究的時候，一些人認為Altman應該因為這個發現得諾貝爾獎， 不過他在2016他去世了。

除了Altman之外，也有其他科學家得到了相同的結論。 1977年Boston大學醫學院的Michael S. Kaplan為了克服成像過程中的誤差造成的影響以及更清晰的觀察到細胞的形態。利用電子顯微鏡對經過注射3個月的大鼠超薄切片進行分析，在嗅球和海馬均發現了被標記的顆粒細胞，證實在成年哺乳動物的嗅球和海馬存在神經發生【13】， 並觀察到了成神經細胞【14】。 他後來的工作也表明在新皮質有被標記的膠質細胞【15】， 並且經過豐富環境刺激之後，在視覺皮層的第四層觀察到了被標記的顆粒細胞【16】。 但是由於他丟失了切片，所以這些結果無法得以複查。據Kaplan自己說因為後來得不到足夠的研究經費，他轉行做了大夫。

不僅在哺乳動物， 鳥類的研究也支持成年動物大腦內仍舊有神經發生的現象【17,18】。 1960年代來自阿根廷在UC Berkley獲得動物學博士的Fernando Nottebohm在洛克菲勒大學開始了他的獨立研究生涯。研究生時期Fernando Nottebohm跟隨導師Peter Marler 進行動物運用聲音進行交流的研究。他們選擇的研究對象是一種叫做蒼頭燕雀(也稱為song bird)的鳥。 這種鳥在發育的特定時期會學會不同的鳴叫， 例如在性成熟求偶期的鳴叫就與普通的鳴叫不同， 而且不同地區的同一種鳥的鳴叫也不盡相同。因此他們認為這種鳥可以作為一個很好的研究對象來回答nature和nurture的問題，甚至有可能為人類語言的學習提供insights【19】。金絲雀做為眾多song bird中其中的一種, 「唱歌」 現象主要發生在性成熟的雄性鳥類。在雄性金絲雀中有2個核團與唱歌現象有關，這2個核團在雄性鳥類中大於雌性。 雌性在經過睾丸酮處理之後有的也能發生唱歌求偶現象， 而發生求偶現象的雌性中這兩個核團體積會增大。 此外在雄性鳥類中， 這兩個核團在求偶的春季會變大， 在哺育期之後的秋季又會萎縮。 因此這2個核團成為了成年之後神經發生是否能夠作為學習的基礎的試金石。

因此Fernando Nnottebohm的實驗室利用雌性金絲雀在接受睾丸酮注射之後會唱歌這一現象做了一個利用3H標記的實驗，他們發現不論注射睾丸酮與否，在成年雌性金絲雀的負責唱歌的合團都有相同比例的神經被標記上， 但是接受睾丸酮刺激的金絲雀有更多的膠質細胞被標記上， 這一結論表明在成年的金絲雀體內存在神經發生的現象【20】。 但是他們發現在雄性金絲雀的負責唱歌的核團可標記的神經元的數目在每年的3月份和10月份最多, 表明成年的神經發生還是跟求偶時鳴叫的能力加強有關【21】。Fernando在金絲雀的神經發生工作中還做了其他大量的工作。從他實驗室出來的Arturo Alvaez Buylla獨立以後在UCSF利用小鼠對成年神經發生的方式，起源等進行了詳細的描述【22-24】, 這在分子生物學的黃金年代顯得尤為可貴. 近年, Buylla的工作由小鼠轉向人【25】。

有了鳥類，小鼠和大鼠的證據之後，下一個就是來自猴子甚至是人體研究的證據來使得這些研究能夠為我們了解自身提供證據。1999年普林斯頓大學的Gould利用一種原理與前文所述標記的胸腺嘧啶類似，新的DNA 標記物BrdU注射成年的恆河猴，並結合免疫染色，報道在跟學習等高級功能相關的大腦皮層區域發現了被標記的神經元【26】。 後來他們在海馬也發現了類似的成年神經發生的現象，在大鼠中的實驗則認為這些新產生的神經元參與到新的偶聯性記憶的形成【27-29】。這些證據加上1998年Salk研究所的Fred Gage將Brdu注射到病人志願者體內，並在病人的海馬發現了被標記的顆粒細胞，這個實驗似乎表明成年神經發生是一種保守並廣泛存在的現象【30】。

如果這些現象真實存在，將為我們理解學習記憶提供新的視角甚至為轉化醫學提供新的治療契機， 因此產生了很大的影響。在這些結果的基礎上也誕生了許多非常有意思的發現， 比如運動或者學習記憶能促進神經發生等等。 但是這些研究與Pasko的結論不同。為此Pasko重新利用Brdu在猴子身上試驗， 除了能在海馬發現被標記的細胞， Pasko Rakic結合自身多年觀察的結果對靈長類新皮質的成年神經發生的現象依然持保留態度並提出了自己的觀點， 他認為那些被標記的細胞不是神經元【31-34】。哈佛的Jeffrey Macklis實驗室甚至發現在正常的情況下甚至小鼠的新皮層都不會發生神經發生現象【35】。 而且瑞典卡羅林斯卡研究所的Jonas Frisen實驗室通過測量DNA中14C的衰變推測細胞產生的時間，並結合人的出生日期，發現在人成年之後皮層幾乎沒有新的神經元產生【36】， 而海馬和紋狀體有新的神經元產生【37-38】。這些證據總結起來似乎表明目前只有皮層在成年之後是否有神經發生存在爭議, 而嗅球、 海馬等腦區在成年好之後的發生神經發生被得到了肯定。

最新的進展

由於以往的實驗多是利用免疫組化的切片在顯微鏡下觀察，因此結論有不同也能理解。 更加可信的證據應該是用遺傳標記神經前體細胞，並對這些細胞在成年之後的命運實行實時觀察。 在這一點上，小鼠就顯得比較有優勢。 2018 年Fred Gage 曾經的博後，現在瑞士蘇黎世大學的Sebastian Jessberger 通過紅色熒光蛋白遺傳標記神經前體細胞，並結合雙光子成像對成年小鼠(10周左右) 的海馬進行在體實時成像分析。通過觀察他們發現在成年小鼠的海馬齒狀回存在新的神經元產生【39】 。這一實驗證據算是很充分的證實了在成年小鼠的海馬存在神經發生。

然而就在學術界基本已經接受在海馬廣泛存在成年之後的神經發生的時候。剛剛在線發表的，來自UCSF的Arturo Alvaez Buylla實驗室、復旦大學腦科學研究院楊振剛和西班牙巴倫西亞大學(Universidad de Valencia)Jose Manuel Garcia-Verdugo的證據似乎表明人的海馬在成年之後也不會有神經發生。他們利用發育不同時段的人和猴的組織進行免疫染色。通過分析組織上著色的分子標記物， 他們認為在人和猴子的海馬隨著發育的成熟， 神經發生的能力逐漸降低【40】, 因此也對成年之後神經發生作為可塑性一種的理論提出了否定性證據。

所以目前為止至於成年之後神經發生在靈長類的皮層和海馬是否存在仍然存疑。不同的科學家對此也採取了不同的態度。隨著遺傳學操作和成像技術的不斷進步， 相信在不久的將來這一問題會得到更充分的回答。

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