《Cell》子刊：華人科學家叫板CTLA-4免疫檢查點阻斷假說

新聞 03-08

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近幾年來，針對CTLA-4、PD-1和PD-L1的單抗藥物在免疫治療中的效果逐漸獲得認可，癌症免疫治療中的免疫檢查點（Immune Checkpoint）概念也越來越深入人心。2018年2月22日，著名期刊Cell Research在線發表了來自美國馬里蘭大學醫學院劉陽/鄭盼教授聯合實驗室的最新研究成果。

研究表明，長久以來流行的抗CTLA-4抗體Ipilimumab在癌症免疫治療中的免疫檢查點假說

並不成立。

即Ipilimumab並沒有通過阻斷CTLA-4/B7相互作用而發揮抗腫瘤效果，而清除腫瘤局部高表達CTLA-4的調節性T細胞（Treg）在有效的免疫治療中至關重要。此項研究成果有助於研發新一代高效的抗CTLA-4抗體以及其它以CTLA-4為靶點的抗癌藥物。

CTLA-4分子高表達於調節性T淋巴細胞（Treg）和激活的T淋巴細胞上。正常情況下，T淋巴細胞的活化需要兩條信號通路共同激活（圖1），其一是T細胞受體（TCR）與抗原呈遞細胞（APC）呈遞的MHC-抗原肽複合物相結合（信號1），其二是B7分子（B7-1或B7-2）與T細胞表面的共刺激分子CD28相結合（信號2）。

T細胞活化後高表達的CTLA-4分子雖然與CD28具有高度同源性，但功能相反，即CTLA-4分子與B7分子結合後抑制T細胞的活化。

2011年，美國FDA批准首款抗CTLA-4抗體抑製劑Ipilimumab（商品名YERVOY）用於黑色素瘤的治療，其療效顯著。根據免疫檢查點阻斷的假說（Checkpoint Blockade Hypothesis），在外周淋巴器官，抗CTLA-4抗體如Ipilimumab是主要通過阻斷抑制性的CTLA-4/B7信號通路（圖1），從而促進T細胞的激活而發揮抗腫瘤作用。然而這一流行的關於Ipilimumab在癌症免疫治療中發揮作用的主要假說並沒有得到嚴格的實驗驗證。

圖1. T細胞的活化需要通過TCR/MHC（信號1）和CD28/B7（信號2）進行共刺激。抗原呈遞細胞（APC）上的B7分子與T細胞上的CTLA-4的結合抑制T細胞功能。抗CTLA-4抗體阻斷CTLA-4結合B7並阻止其對T細胞功能的抑制。

雖然Ipilimumab可以阻斷錨定狀態的CTLA-4分子和遊離的B7分子的相互作用（圖2A），但B7分子是膜表面表達的共刺激分子，因此以前的研究並不能證實Ipilimumab能夠有效阻斷在生理狀態下的CTLA-4和B7的相互作用。劉陽/鄭盼教授聯合實驗室的研究表明，當B7分子被固定後（比如B7包被在ELISA板上時[圖2B]或者表達在細胞表面時[圖2C]），Ipilimumab在體外並不能很好地阻斷細胞表面的CTLA-4/B7的相互作用（圖2D），也不能有效地阻斷CTLA-4介導的B7分子的轉胞吞（Transendocytosis）作用（圖2E）。

與此不同的是，劉陽/鄭盼教授聯合實驗室篩選出的另外一種抗CTLA-4的抗體L3D10，卻能非常顯著地阻斷各種形式的CTLA-4/B7的體外相互作用（圖2）。此外，在human CTLA-4 knock-in的人源化小鼠和human CD34+ stem cells重組的NSG小鼠中，L3D10而不是Ipilimumab，能夠顯著抑制human CTLA-4對脾臟樹突狀細胞表面B7分子的轉胞吞下調（圖2F），從而提供了在體內實驗中的生理狀態下Ipilimumab不能有效阻斷CTLA-4/B7相互作用的證據。

圖2. 當B7分子被固定時，L3D10而不是Ipilimumab，能夠在體外和體內顯著阻斷CTLA-4/B7的相互作用。

更重要的是，劉陽/鄭盼教授聯合實驗室的研究指出，阻斷CTLA-4/B7的相互作用，並沒有貢獻於抗CTLA-4抗體的抗腫瘤效果。這一論斷來自多個方面的實驗證據：

（1）

在human CTLA-4全人源化（CTLA4h/h，即CTLA4的兩個等位基因均來自human）的小鼠模型中，抗human CTLA-4的抗體L3D10能夠有效阻斷CTLA-4/B7的相互作用；而在human CTLA-4半人源化（CTLA4h/m，即CTLA4的兩個等位基因一個來自human，一個來自mouse）的小鼠模型中，只能識別human CTLA-4的L3D10不能有效阻斷CTLA-4/B7的相互作用。儘管如此，在CTLA-4全人源化和半人源化的小鼠模型中，L3D10和Ipilimumab都能有效的消除MC38腫瘤（圖3A和圖3B）和減緩B16腫瘤的生長。

（2）

將半人源化的L3D10進行完全人源化後篩選得到的兩株失去阻斷CTLA-4/B7相互作用能力的HL12和HL32抗體（圖3C），並沒有影響其抗腫瘤的作用，因為HL12和HL32展現出與Ipilimumab一樣的抗腫瘤效果（圖3D）。

（3）

用B7分子的阻斷性抗體1G10/GL1處理實驗小鼠，在事先阻斷B7功能的情況下，Ipilimumab仍能發揮有效的抗腫瘤作用，進一步說明其並不依賴於阻斷抑制性的CTLA-4/B7信號通路（圖3E）。

圖3. 抗CTLA-4抗體治療腫瘤的主要分子機制是通過清除腫瘤局部的Treg，而不是通過阻斷CTLA-4/B7相互作用的抑制性信號通路。

深入研究表明，所有能有效抗腫瘤的抗CTLA-4抗體，包括強阻斷能力的L3D10和非常弱阻斷能力的Ipilimumab/HL12/HL32，都能夠有效的清除腫瘤局部的Treg（圖3F和圖3G）。而用Fc受體的阻斷抗體2.4G2同時處理小鼠來消除抗體介導的細胞殺傷作用和抗體介導的細胞吞噬作用，則能顯著逆轉Ipilimumab的抗腫瘤效果（圖3H）。

因此，劉陽/鄭盼教授聯合實驗室的研究表明，抗CTLA-4抗體發揮治療腫瘤功效的主要分子機制是通過清除腫瘤局部的Treg，而不是通過阻斷CTLA-4/B7相互作用的抑制性信號通路。這項研究有力地駁斥了當前流行的在癌症免疫治療中針對CTLA-4分子的免疫檢查點的理論假說。

本研究完成於作者先前所在的美國國立兒童醫學中心的癌症與免疫學研究中心。作為論文的共同第一作者，杜雪相博士和唐飛博士在劉陽教授和鄭盼教授的共同指導下完成了此課題的主要內容，劉明月博士貢獻了部分數據。美國OncoImmune, Inc公司、美國Immutics, Inc公司以及中國Alphamab, Inc公司提供了抗體等實驗試劑和Biacore等技術支持。本研究得到來自美國國立衛生研究院和OncoImmune, Inc公司的基金資助。

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