揭秘：尿路上皮膀胱癌的基因組特徵及免疫檢查點抑製劑成功治療的原理

導讀

膀胱尿路上皮癌（UBC）是全世界最常見的致死性癌症之一，卡介苗膀胱內免疫治療是非肌層浸潤性UBC的標準治療方案。然而，過去的十年中，當代治療方案並未明顯改善患者的5年生存期。最新研究發現，部分局部晚期或轉移性UBC患者對抗PD-1/PD-L1或CTLA-4檢查點免疫治療產生了反應，而在過去兩年中，FDA批准了五種檢查點抑製劑用於UBC治療，這是晚期UBC治療的巨大創新。

免疫系統分為固有免疫和適應性免疫，可以識別並摧毀惡性轉化的細胞。宿主適應性免疫具有高度特異性、快速適應性以及長期記憶的特徵。T細胞活化發生於特異性T細胞受體（TCR）與MHC呈遞的抗原肽相互作用，CD28-B7共刺激增強MHC-抗原-TCR複合物的親和力之後。T細胞被激活後，進行增殖和分化，並釋放細胞因子，如干擾素γ（IFN-γ），攻擊表達特定抗原的細胞。最新研究表明，內在負反饋信號轉導可能控制T細胞過度反應，因此，T細胞活化也會誘導最終減弱並終止T細胞應答以維持免疫系統平衡的抑制通路。眾所周知，檢查點分子包括CTLA-4，PD-1/PD-L1。T細胞功能和免疫系統穩態取決於「開啟」和「關閉」開關。

免疫監視是一種遺傳機制，循環T細胞和B細胞可以通過這種機制將癌前細胞識別為「非我物質」，隨後，免疫細胞攻擊並破壞非正常細胞。免疫編輯通過註解三個階段，詳細描述了腫瘤細胞與免疫系統之間的動態相互作用：免疫清除、免疫平衡和免疫逃逸。活化T細胞成功抵抗腫瘤取決於腫瘤微環境的複雜性。腫瘤微環境是一種具有不同細胞類型的生態系統，它包含但不僅限於絕大多數腫瘤細胞，分散的基質細胞，抑制性細胞因子，調節性T細胞，髓源性抑制細胞，抗原，MHC分子表達以及腫瘤或免疫細胞表達PD-L1。因此，依據腫瘤浸潤性淋巴細胞的數量和含量以及PD-L1蛋白的表達，TME劃分為免疫原性「熱」TME或非免疫原性「冷」TME。應用獨特生物標誌物監測「熱」和「冷」TME可能是指導治療的良好指標。

腫瘤免疫治療包括注射特異性細胞因子，腫瘤相關抗原疫苗，輸注過繼性自體T細胞或基因工程T細胞，或者免疫檢查點抑製劑。最新研究發現，腫瘤發生期間，體細胞突變產生的特異性新抗原可以誘導高度選擇性T細胞應答，並且這些新抗原逐漸成為了極具吸引力的治療靶標。治療方案雖不同，但是它們均旨在增強免疫系統的活性，從而增強機體抵禦癌症的天然防禦機制。免疫檢查點抑製劑開創了晚期膀胱癌治療的新紀元。

尿路上皮膀胱癌的基因組特徵

UBC是全世界最常見的泌尿道癌症之一。一般地，男性多於女性（比例3~4:1），複發率、轉移率和死亡率很高。複發或轉移性膀胱癌患者應用以順鉑為基礎的化療方案後中位生存時間為14-15個月，但是目前尚未發現可以延長總生存時間的有效二線治療方案。最近，PD-L1抑製劑（atezolizumab, durvalumab, 和avelumab）和PD-1抑製劑（nivolumab和pembrolizumab）獲FDA批准用於晚期或轉移性UBC治療。FDA批准的臨床研究表明，整體客觀緩解率（忽略PD-L1表達）為13%-24%，那麼，問題來了：為什麼某些患者對檢查點抑製劑治療有反應，而其他患者卻沒有呢？

早期研究表明，黑色素瘤和NSCLC的基因不穩定性與檢查點抑製劑治療反應有關。同樣地，尿路上皮細胞基因組和表觀基因組改變是UBC發病機制的驅動力。首先，UBC是具有最高突變負荷的癌症之一。體細胞平均突變率為7.7每兆鹼基，僅次於黑色素瘤和NSCLC，逾30%的膀胱癌患者具有超過192個非同義突變。每個樣本中平均有204個基因組拷貝數片段改變，302個非同義基因突變，以及22個基因組重排，UBC特異性已知基因CDKN1A (P21)， EGCC2 (XPD)，RXRA，ELF3（E74樣ETS轉錄因子3），KLF5（轉錄因子），FOXQ1（叉頭框蛋白Q1），RHOB（Rho相關GTP結合蛋白RhoB），PAIP1（多聚腺苷酸結合蛋白相互作用蛋白1）以及BTG（B細胞易位基因）以＞3%的頻率顯著變異。

其次，多種染色質重塑基因，如KDM6A（賴氨酸脫甲基酶6A），CREBBP，EP300，和ARID1A（AT豐富結構域1A）在膀胱癌中高度突變。UBC腫瘤基因圖譜計劃（TCGA）研究發現，調控染色質重塑的基因在UBC中更頻繁地發生突變。再次，染色體重排（如FGFR3–TACC3融合基因）和病毒整合（如HPV16）在UBC中周期性結構變異。以上基因組改變不僅改變了腫瘤細胞基本通路（p53/RB細胞周期通路，RTK/PI3K/mTOR增殖通路）特徵以及UBC潛在藥物靶標-組蛋白修飾染色質調控網路，也產生了許多可以被活化的效應T細胞識別的非我，或「外來」蛋白質。

此外，腫瘤體細胞突變產生的新抗原與抗PD-1或抗CTLA-4治療反應正相關。PD-L1表達可能與更強的治療反應相關，但是由於低PD-L1表達或無PD-L1表達的膀胱癌較傳統化療具有更強的反應療效和更好的耐受性，因此PD-L1表達並非是最完美的生物標誌物。最近，一項將atezolizumab作為順鉑不合格，局部轉移性UBC患者一線臨床治療方案的II期試驗證實，膀胱癌的基因組特徵可能解釋了免疫檢查點抑製劑治療帶來的良好臨床獲益。

膀胱癌免疫治療

免疫檢查點抑製劑主要靶向腫瘤細胞或免疫細胞上表達的分子，這些分子作為「剎車」，會阻斷T細胞的有效功能。檢查點抑製劑治療會釋放「剎車」，進而促進預先存在的抗癌免疫反應。研究證實，CTLA-4, PD-1和PD-L1抑製劑在轉移性黑色素瘤，晚期NSCLC，腎細胞癌以及晚期膀胱癌治療中表現出顯著的抗腫瘤反應。

非肌層浸潤性膀胱癌（NMIBC）免疫治療

NMIBC治療的主要方式為腫瘤完全切除，然後誘導並維持膀胱內BCG疫苗免疫治療或膀胱內灌注化療。中至高危NMIBC患者BCG膀胱灌注治療反應可達60%-70％，並具有長期治療療效。儘管高危NMIBC患者BCG免疫治療取得了成功，但是?30％的患者對治療無反應。TME證據可能影響BCG治療反應。BCG治療失敗的腫瘤具有少量效應細胞和較多抑制性免疫細胞，例如，腫瘤中CD4+亞群和GATA3+ T細胞很少；TME中FOXP3+，CD25+ Treg以及CD68+和CD163+腫瘤相關巨噬細胞表達很高。這種不斷變化的複雜細胞生態學導致BCG治療無應答。因此，BCG結合其他方法可能會改變TME和宿主免疫原性。一項研究表明，CTLA-4分子阻斷劑聯用標準BCG治療可以增強患者的免疫活性，並改善NMIBC的臨床結局。正在進行的檢查點抑製劑和其他新型藥物組合臨床試驗將為BCG難治性患者提供臨床獲益。

晚期和轉移性膀胱癌免疫治療

晚期或轉移性膀胱癌患者的標準治療包括順鉑為基礎的化療，然後手術切除膀胱，或放療以及聯合化療。新修訂的指南指出，對於未能從一線化療獲益的患者，免疫治療將是一種重要的治療方法。Atezolizumab是一種新研發的人抗PD-L1抗體，可以阻斷PD-1受體與PD-L1結合，導致PD-1/PD-L1通路失活。Atezolizumab早期臨床試驗表明，晚期BCG患者常常在短時間內開始緩解，許多患者在6周內出現緩解，反應率為~48%。一項將PD-L1表達作為強大生物標誌物來篩選受試者的I期研究結果表明，如果腫瘤浸潤性免疫細胞表達PD-L1蛋白，那麼腫瘤具有高反應率。另外，相較於細胞毒性化療，檢查點抑製劑治療患者不良反應較少。因此，2016年5月atezolizumab獲FDA批准用於晚期或轉移性膀胱癌治療。隨後的II期臨床研究（單臂和多中心）納入了315例患者，結果表明，客觀緩解率（14.8％）顯著，臨床反應持久。另一項試驗表明，atezolizumab可作為未經治療的轉移性尿路上皮癌患者的初步一線治療選擇，客觀緩解率為23％，這一發展正在改變UBC的治療模式。

Durvalumab是另一種新興PD-L1抑製劑。I期/ II期臨床試驗表明，durvalumab具有可控的安全性，PD-L1陽性轉移性膀胱癌患者的客觀緩解率為46.4％。基於這些結果，研究人員正在進行durvalumab單用或durvalumab+CTLA-4抑製劑，tremelimumab的多項臨床試驗。抗CTLA-4（ipilimumab和tremelimumab）或抗PD-1（pembrolizumab和nivolumab）單葯治療也處於不同階段的臨床試驗中。2017年，FDA批准了四種檢查點抑製劑，包括nivolumab（2017年2月2日），durvalumab, avelumab,和pembrolizumab（2017年5月），用於晚期膀胱癌二線或一線治療。

腫瘤具有異質性，免疫治療後出現動態緩解。TME中抑制性或刺激性分子表達較想像的更複雜。不同檢查點抑製劑組合的多免疫治療是一種必要的治療方式，並且已經證實其在轉移性黑色素瘤和晚期NSCLC中具有協同或累加療效。因此，應用劑量優化、相繼次序且安全性良好的多種檢查點抑製劑治療膀胱癌是合理的治療選擇。另外，傳統治療（化療、放療、手術或靶向治療）結合免疫檢查點治療可能提高緩解率，使更多腫瘤患者獲益。

免疫檢查點抑製劑治療的預測性生物標誌物

免疫檢查點抑製劑治療已經在多種惡性腫瘤（如UBC）中表現出顯著的臨床療效，持久緩解和低毒性。抗CTLA-4和抗PD-1抗體能夠使部分晚期黑色素瘤患者獲得長期疾病控制；靶向PD-1蛋白的抗體治療在晚期NSCLC，黑色素瘤和腎細胞癌中的客觀緩解率分別為18%, 28%, 和27%；早期試驗表明，晚期膀胱癌抗PD-1治療緩解率可達43.3%，後期大型隊列研究表明，篩選的受試者緩解率＞10%。然而，大多數檢查點抑製劑治療患者並未出現緩解，因此，為獲得更好臨床結果，通過生物標誌物來分層或預測應答者至關重要。

CTLA-4在T細胞活化早期階段發揮作用，而PD-1/PD-L1軸在晚期階段起作用。2008年，一項臨床試驗納入了12例早期UBC患者，並於根治性膀胱切除術前，對患者進行抗CTLA-4（ipilimumab）治療，結果顯示，誘導性共刺激因子（ICOS）表達在腫瘤組織和外周血液的CD4+T細胞亞群中顯著增加。CD4+ICOShi T細胞亞群會釋放更多有效的細胞因子，活化的免疫細胞可以識別腫瘤/睾丸抗原。此外，抗CTLA-4治療與ICOS+CD4+T細胞亞群增加的相關性可以監測CTLA-4抑製劑的有效性。增強TME中效應因子和輔助T細胞功能或消耗Treg可能會增強CTLA-4抑製劑治療的功效。

晚期黑色素瘤中，高體細胞突變負荷與CTLA-4抑製劑治療長期臨床獲益相關，體細胞新表位負荷與CTLA-4抑製劑反應相關。如果患者具有更高的體細胞突變負荷，那麼經atezolizumab治療的轉移性尿路上皮癌患者將獲得更好的緩解。相較於無應答者，atezolizumab應答者的中位突變負荷顯著增加。更嚴格講，體細胞突變負荷與緩解之間的相關性與TCGA尿路上皮癌亞型或PD-L1表達亞組無關。膀胱癌的突變負荷是否可以作為檢查點抑製劑治療的獨立預測參數仍需要大隊列試驗驗證。突變表位與腫瘤內CTL浸潤和記憶T細胞數量正相關。腫瘤周圍高密度CD8+浸潤與經atezolizumub治療的晚期尿路上皮癌患者出現較好緩解相關，這表明免疫原性突變高負荷可能預測經檢查點抑製劑治療緩解的患者。然而，PD-L1表達，突變負荷與膀胱癌亞型組合可能能夠說明轉移性膀胱癌經檢查點抑製劑治療反應率的複雜性。

PD-1/PD-L1通路的作用機制不同於CTLA-4信號通路；TME中腫瘤細胞或免疫細胞表達PD-L1蛋白會抑制T細胞功能。因此，大多數研究將PD-L1蛋白作為生物標誌物來篩選靶向PD-1/PD-L1通路抗體治療的患者。一般而言，PD-L1表達越高，客觀緩解率和生存率越好。抗PD-L1分子治療轉移性膀胱癌I期研究中，若預處理的腫瘤樣本中PD-L1陽性腫瘤浸潤細胞＞5%，則PD-L1陽性腫瘤患者應用抗PD-L1單葯治療。在最少6周的隨訪中，相較於PD-L1陰性腫瘤患者（11.4%），PD-L1陽性腫瘤患者客觀緩解率為43.3%。

儘管腫瘤組織中PD-L1蛋白表達與相對較高的緩解率相關，但是仍然存在悖論現象，即PD-L1治療後，許多PD-L1陽性腫瘤確實無緩解，某些PD-L1陰性腫瘤卻出現臨床反應（腫瘤縮小或腫瘤穩定）。值得注意的是，nivolumab治療，durvalumab治療或pembrolizumab治療的晚期尿路上皮癌患者的生存獲益與PD-L1表達水平不一致。這些觀察結果表明，仍需要其它生物標誌物進行更精準，更精細的預測。

在基因水平上，錯配修復缺陷NSCLC和結直腸癌體細胞總突變負荷與PD-1抑製劑治療臨床反應相關。某些研究表明，新抗原負荷或克隆新抗原負荷與抗PD-1反應顯著相關。除了遺傳基礎之外，轉錄特徵也是PD-1分子拮抗劑的潛在預測因子。

總結與展望

調節免疫細胞的抑制通路一直是腫瘤治療的重大突破。大量研究已證實，應用人源化抗體靶向PD-1，PD-L1和CTLA-4蛋白的免疫檢查點阻斷療法在部分晚期黑色素瘤，轉移性NSCLC，轉移性腎細胞癌和晚期膀胱癌患者中具有良好的臨床反應，長期疾病控制和生存期改善。由於T細胞調節網路中存在許多其他的分子，研究人員正在積極研發新的拮抗劑來靶向其他抑制通路，如LAG-3，T細胞免疫球蛋白與黏蛋白結構域分子3，T細胞活化的V結構域免疫球蛋白抑製劑，和B淋巴細胞和T淋巴細胞抑製劑，以及促進刺激通路的激動劑（如ICOS，CD134和CD137）。

值得注意的是，新的有說服力的證據表明，免疫原性新抗原和細胞毒性T細胞識別新抗原是臨床免疫反應的代表。個體化新抗原疫苗和免疫檢查點抑製劑組合可能在多種實體瘤中取得更好的臨床獲益。另一方面，癌細胞可以逃避免疫監視，在選擇性壓力下，富含腫瘤浸潤性淋巴細胞的腫瘤中可檢測到高水平HLA基因突變，以及抗原-呈遞-機制基因中的其他突變。因此，整體而言，研發用於精準膀胱癌免疫治療、且具有完全預測性和預後性的生物標誌物仍然面臨挑戰。

文章編譯自：Wen Cheng, Dian Fu, Feng Xu & Zhengyu Zhang.Unwrapping the genomic characteristics of urothelial bladder cancer and successes with immune checkpoint blockade therapy.10.1038/s41389-017-0013-7.January 2018.

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