中國科學家完成國際首個胃癌蛋白質組分子分型——專家點評

自21世紀以來，生命科學各類計劃一直由歐美國家領導，由美國牽頭的人類腫瘤基因組計劃（TCGA）【1】，在過去十幾年裡描繪了數十種腫瘤的基因組變異圖譜，繪製了癌症的基因組「地形圖」，為人類對癌症的理解做出了巨大的貢獻，也催生了美國的「精準醫療計劃」和「腫瘤登月計劃」。蛋白質作為生命活動的執行者，和基因相比應該與疾病有更直接的關聯，而作為後基因組時代的蛋白質組學【2,3,4】在中國的發展一直保持著與國際齊頭並進的態勢。2014年啟動的「中國人類蛋白質組計劃」（CNHPP）通過繪製人類十大惡性腫瘤的蛋白組「地形圖」，試圖在蛋白這個更高級的維度上理解腫瘤，揭示腫瘤的分子機制，尋找治療靶標。

日前，Nature Communications在線發表了一項由國家蛋白科學中心（鳳凰中心）與北京大學腫瘤醫院共同開展的瀰漫型胃癌蛋白質組研究最新成果，論文共同通訊作者分別為國家蛋白科學中心秦鈞教授，北京大學腫瘤醫院沈琳教授和軍事科學院賀福初院士。文章首次描繪了瀰漫性胃癌的蛋白質組全譜，繪製了胃癌的蛋白組「地形圖」，為深刻理解胃癌分子機制提供了寶貴素材並為胃癌病人的精準醫療提供依據。為了讓更多專業同行深入了解該工作，BioArt特別邀請到長期從事蛋白組學相關研究的西湖高等研究院郭天南研究員進行深度專業點評，以饗讀者！

胃癌在全球腫瘤死亡原因中排名第三【5】。我國是胃癌發病和死亡的重災區，2012 年新發胃癌40.5萬，佔全世界的40%以上【6】。目前國際上廣泛應用的Lauren分型從形態學上將胃癌分為腸型、瀰漫型和混合型，其中瀰漫型預後最差，且缺少有效的靶向治療手段【7】。儘管國際上發表過基於基因組和轉錄組的胃癌分子分型，但均沒有與臨床預後實現有效的關聯性。和基因測序相比，蛋白組測量在技術上極具挑戰。由於蛋白具有不能直接擴增的特性，蛋白組測量的靈敏度、通量和穩定性一直是困擾蛋白組領域的難題。

據BioArt了解，從2012年開始，在北京市科委前沿項目的資助與301醫院陳凜主任的大力協助下，秦鈞團隊歷時兩年基本打通胃癌蛋白組學分析技術路線。從2014年開始，該團隊聯合北京腫瘤醫院沈琳主任團隊開始大規模胃癌樣品分析。該項研究收集了2012年12月至2015年7月在北京腫瘤醫院進行手術的2451例胃癌樣品，篩選得到84對滿足研究要求的癌和配對的癌旁組織樣本。自此，團隊開啟了繪製首個瀰漫型胃癌蛋白質組學圖譜和腫瘤驅動基因變異圖譜的征程。到2016年6月，團隊基本完成84對樣品的質譜測量工作，共鑒定到11340 個不同的基因產物，這些蛋白質覆蓋了腫瘤細胞及腫瘤微環境所有可能表達的蛋白。在數據分析過程中，適逢團隊歷時5年建立的國際首個蛋白質組一站式分析雲平台Firmiana（詳見BioArt此前的報道：Nat Biotech：中國學者建立國際首個一站式蛋白質組數據分析雲系統Firmiana）開始運行，這催生了胃癌表達譜分子分型工作流，候選藥物靶標分析工作流，和基因變異與蛋白關聯分析工作流的建立【8】。

經過一年多的數據分析和知識挖掘探索，秦鈞團隊欣喜地發現僅對84 對胃癌與癌旁組織全蛋白表達譜進行聚類分析，就可以將瀰漫型胃癌分為三個分子亞型（PX1~3），而且這三個亞型與生存預後和化療敏感性密切相關。這是世界上第一次實現在蛋白層面上對腫瘤進行分子分型，且分的的亞型與預後和化療有顯著性關聯！其中PX1 型（細胞周期型），總生存時間最長；PX2 型 (上皮-間充質轉化型)，生存預後介於PX1 和PX3 之間；PX3 （免疫通路富集型）患者腫瘤組織高表達蛋白富集在免疫響應相關通路和EMT 相關蛋白上，總生存時間最短，並且該組患者對化療不敏感。特別令人激動是，這種蛋白分型不依賴於任何基因組信息，體現出作為功能直接執行者的蛋白質在臨床科學中所提供信息的重要性和全面性。文章進一步的研究篩選出23個與預後相關的胃癌候選蛋白藥物靶標，並提示瀰漫型胃癌在以下四個通路最有可能找到治療靶標：經典的腫瘤生長通路、代謝和氧化應激過程、細胞黏附和侵襲過程以及腫瘤和腫瘤微環境中的免疫調控。

團隊同時也定向檢測了276個腫瘤Driver 基因的突變，發現183個基因能檢出突變。令人吃驚的是，研究發現有13%（25/183）基因可以檢測到突變，但在癌與癌旁中均未檢測到其蛋白表達。更驚奇的是，在幾例病人的樣品中，研究人員可以檢測到著名的KRAS和NRAS 」激活「突變，在癌旁也可以檢測到蛋白，但在癌中卻檢測不到KRAS 或NRAS蛋白。這預示著基於RAS 基因測序作指導的精準醫療，在這些病人中或許會出問題，因為治療的蛋白靶點在腫瘤中是不存在的。

單獨依靠基因組數據而不依靠蛋白質組數據來進行基因的功能預測，甚至作為靶向治療的依據，其可靠性是值得懷疑的。這提示我們人類健康醫療呼喚蛋白組學驅動的精準醫學。

胃癌蛋白質組「地形圖」的完成，標誌著以賀福初院士為首席科學家的「中國人類蛋白質組計劃」（CNHPP）攻下了第一座精準醫學城池，是中國十餘年蛋白質組研究成果的具體展示。這個課題的科學意義在於向人們展示，測量蛋白就可以實現腫瘤的分子分型，發現腫瘤治療的靶標，激發人們開展蛋白組學臨床轉化的潛能，是實現蛋白組學驅動的精準醫學的曙光。

題外話：從科技創新角度講，該研究是我國蛋白組學從「跟跑」、「並跑」逐漸轉變為「領跑」的體現。從整個項目的實施過程來看，平台、方法都是從無到有，最終建立了一站式中國蛋白組學和生物信息學的分析平台，實現了從0到1的突破。更重要的是，該項目的實施，培養了中國蛋白組學的隊伍， 奠定了CNHPP 的技術流程和科研思路。

花絮：秦鈞團隊為什麼選擇胃癌作為研究方向呢？這裡面有個小插曲。據秦鈞教授透露，2012年底，北京蛋白質組研究中心的一位同事被診斷為胃癌，秦鈞團隊遂決定將蛋白質組研發平台用於開展胃癌蛋白組學研究，為更加詳盡理解胃癌提供蛋白組學數據，為病人服務。

同行點評：

評鳳凰中心和北京大學腫瘤醫院的關於瀰漫性胃癌的蛋白質組分型的合作研究

郭天南（西湖高等研究院研究員）

要深入理解近期鳳凰中心和北京大學腫瘤醫院合作發表的這篇文章，筆者認為讀者有必要對相對比較新的蛋白質組領域有一定的了解，故試簡述如下。

在很大程度上，精準醫學時代的預熱和到來，主要是由人類基因組計劃的完成和應用推動的。除了在一些遺傳性疾病的傑出應用，人類基因組計劃有力的推動了基因組和轉錄組測序技術的快速發展。近20年來，測序的價格實現了指數性的降低。以華大基因為代表，我國科學家使用基因組測序和轉錄組測序技術在多個領域取得了令世界矚目的科學成就和應用成果。近來，我國在單細胞的基因組和轉錄組測序領域也相對處於世界領先地位（見Bioart近期有關報道）。

蛋白質是生命活動最重要的物質，是DNA和RNA參與絕大部分生命活動的具體執行者。絕大多數蛋白質都具有複雜的三維結構，甚至四級結構（多個蛋白質形成的複合物），這些獨特的結構信息對理解蛋白質的基本功能和藥物設計具有重要指示作用。近10年來，我國在蛋白質結構分析領域取得了一系列重要進展，就研究成果而論不亞於歐美等科技發達國家。

在生命活動中，蛋白質的另一個關鍵因素是其表達水平，例如蝌蚪和青蛙的區別主要是由於蛋白質表達水平的變化。蛋白質組學研究是一門系統測量蛋白質表達水平的學科。中國在較早期就參與了這一學科的建設，在人類蛋白質組學組織的成立和壯大中發揮了重要作用。近幾年，美國階段性結束了癌症基因組圖譜計劃（TCGA），開啟了臨床腫瘤蛋白質組計劃（CPTAC），展開多項國內國際合作，對經過基因組測序的腫瘤再進行蛋白質組學研究。在我國，以鳳凰中心為代表的科研人員也啟動了中國人類蛋白質組計劃（CNHPP），期望繪製10種惡性腫瘤的蛋白質組圖譜，從蛋白維度理解腫瘤的分子機制，尋找治療靶點。

值得一提的是，雖然蛋白質組學在近20年來持續快速發展，但是仍未達到如基因組和轉錄組學一般的成熟水平。筆者認為蛋白質組學研究尚未獲得其應有的關注度。在這一背景下，鳳凰中心持續多年努力，推動我國的蛋白質組學研究，在近期湧現出了一系列令人矚目的成果。去年，鳳凰中心、華東師範大學和復旦大學合作發表了基於雲存儲和雲計算的一站式蛋白質組數據分析平台Firmiana（中文意指引鳳之巢梧桐樹）【8】。這次，鳳凰中心和北京大學腫瘤醫院合作發表了使用鳳凰設施對84位瀰漫性胃癌患者的組織進行的蛋白質組學研究，提出了基於蛋白質表達水平的PX分型。

在這篇文章中，作者層層篩選出84位瀰漫性胃癌患者，提取他們的腫瘤和癌旁組織，使用fast-seq的無標記鳥槍蛋白質組的技術【9】，對168個組織樣本逐個進行了6個組分的預分離，再使用Thermo Fisher的Q Exactive Plus和Q Exactive HF質譜儀進行75分鐘高效液相色譜梯度的檢測，共計產生1008個原始文件。數據先使用Proteome Discoverer 1.4和NCBI Refseq蛋白質資料庫對數據進行分析，然後使用iBAQ作無標記定量。在不高於1%的多肽和蛋白的假髮現率的水平上，作者鑒定到11340個基因產物蛋白質（Gene Products，簡稱GPs），包括腫瘤細胞及腫瘤微環境表達的蛋白。這是目前在腫瘤蛋白質組領域，繼結直腸癌、乳腺癌和卵巢癌之後的又一個重大進展，也是目前針對瀰漫型胃癌研究覆蓋率最高的蛋白質組學數據集。

為進一步提高數據質量，作者對數據進行了更加嚴格的篩選，發現9186個GPs含有至少2個獨立多肽。考慮到非標記定量的缺失值和準確性，作者最終選擇了3619個GPs進行主成分分析，並從中挑選了2538個GPs對瀰漫性胃癌進行組織的臨床分型。此外，作者還對樣本進行了靶向外顯子測序，測量了274個癌症相關基因的突變狀態。從蛋白質組的數據數量和質量上看，這項研究是近年來國際癌症蛋白質組領域發表的最好的成果之一。這項研究對在亞洲（包括中國）發病率相對較高的胃癌的蛋白質組進行了最詳盡的分析，是近年來國際癌症蛋白質組領域發表的最好成果之一。筆者個人認為，這項研究是我國臨床蛋白質組學至今為止取得的最好成果。

僅僅基於蛋白質組數據，作者將瀰漫型胃癌分為三個分子亞型（PX1~3）：PX1 型，富含細胞周期調控蛋白的異常表達，基因突變數目最少，總生存時間最長；PX2 型，表現出上皮-間充質轉化的蛋白質調控異常，生存預後介於PX1 和PX3 之間；PX3，腫瘤高表達免疫響應相關通路蛋白和EMT 相關蛋白，總生存時間最短，並且該組患者對化療不敏感（下圖）。這個分型如果能夠在獨立隊列中得到驗證，有望對臨床診療產生實際影響。

這項成果的主要領導者之一秦鈞教授曾在美國貝勒醫學院工作多年，在千人計劃的資助下回國開展研究工作。在基因組和轉錄組學大步高歌、而蛋白質組學尚不成熟的特殊時期，秦教授回國後看準蛋白質組學在臨床醫學的應用潛力，跳出舒適區，全力以赴的攻關一個對他個人、對世界而言都是充滿挑戰的領域--臨床蛋白質組學。他與軍事醫學科學院的賀福初院士和其他同仁們一起建立了國家蛋白質中心（北京），從零開始建立了一整套從樣本製備、質譜分析到數據分析的質譜設施，培養了大批專業人才和學生，並且參與舉辦多次蛋白質組學培訓課程和國際國內學術會議，為中國蛋白質組學的發展做出了重大貢獻。

這篇文章所報道的成果是由鳳凰中心與北京大學腫瘤醫院的臨床科學家們合作研究所獲得的。臨床研究相較一般生物學研究而言難度更高，需要的積累更多，遇到的實際困難也更多。在目前國內相對比較浮躁的學術環境下，秦教授和同仁們保持初心，不計一時得失，嚴謹的篩選樣本，從2000多個樣本中一步一步篩選到84個樣本，並仔細整理臨床資料，從1萬多個基因產物蛋白質中一步一步篩選到2000多個能夠對胃癌分型的關鍵蛋白。筆者認為，這種嚴謹的科學研究態度尤其值得我們學習。

這項成果是賀福初院士和秦鈞教授推動的「中國人類蛋白質組計劃」（CNHPP）中的一個里程碑，但是筆者相信這一成果絕不會是最後一項成果，也不一定是最重要的一項成果，而是一個嶄新的開端。將蛋白質組學真正應用於胃癌診治的臨床實踐，還有不少科學和技術的障礙；除了胃癌，還有多種腫瘤正困擾著國人和全世界人民；除了癌症，還有眾多疾病也需要新一代的基於蛋白質診斷的精準醫療方案去解決。

我們期待鳳凰中心能獲得更多的成果，帶動中國蛋白質組學的全面發展，從而讓中國在蛋白質領域能夠真正引領世界，讓中國在基於蛋白質的臨床診療佔據戰略高地。（完）

致謝：感謝西湖高等研究院的沈小蓮和李凱娜對本文的修改。

參考文獻：

1.The Cancer Genome Atalas NIH https://cancergenome.nih.gov/

2.Zhang, H., Liu, T., Zhang, Z., Payne, S. H., Zhang, B., McDermott, J. E., et al. (2016). Integrated Proteogenomic Characterization of Human High-Grade Serous Ovarian Cancer.Cell, 166(3), 755–765.

3.Mertins P., Mani DR., Ruggles KV., Gillette MA., Clauser KR., Wang P., et al (2016). Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer.Nature.2016 Jun 2;534(7605):55-62.

4.Zhang, B., Wang, J., Wang, X., Zhu, J., Liu, Q., Shi, Z., et al. (2014). Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer.Nature, 513(7518), 382–7.

5、Siegel, R. L., Miller, K. D. & Jemal, A. Cancer statistics, 2016.CA Cancer J. Clin. 66, 7–30 (2016).

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7、Grabsch, H. I. & Tan, P. Gastric cancer pathology and underlying molecular mechanisms.Dig. Surg.30, 150–158 (2013).

8.Feng, J., Ding, C., Qiu, N., Ni, X., Zhan, D., Liu, W., Xia, X., Li, P., Lu, B., Zhao, Q., et al. (2017). Firmiana: towards a one-stop proteomic cloud platform for data processing and analysis.Nat Biotechnol35, 409-412.

9、Ding, et al. A fast workflow for identification and quantification of proteomes.Mol Cell Proteomics. 2013 Aug;12(8):2370-80.

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