ctDNA液體活檢在乳腺癌精準醫療中的應用

中國人民解放軍總醫院 王建東教授

液態活檢是2015年度世界十大突破技術之一，對於疾病癥狀、預後的檢測、腫瘤治療效果的評估等都可以起到很大的作用。

一、關於ctDNA

循環腫瘤DNA( circulating tumor DNA，ctDNA)是腫瘤細胞在壞死、凋亡後釋放的一種遊離DNA(cell free DNA，cfDNA)，由於其在血液中循環，所以對ctDNA的檢測可以及時反映腫瘤狀態。ctDNA作為一種「液體活檢」，其簡便、快捷、微創以及在一定程度上克服腫瘤時間和空間的異質性等優勢，越來越受到研究者的青睞。

ctDNA當前已廣泛應用於以下領域：

①治療前腫瘤分子分型，參與靶向治療選擇決策;

②在治療過程中評估腫瘤動態和負荷變化，實時監測治療的有效性;

③監測微小殘留病灶和複發、預後評估、監測耐葯的產生以及發現新的治療靶點。

ctDNA發現及應用的主要歷程如下：1948年，循環遊離DNA（cfDNA）被發現並能夠分離出來，1989年，發現循

環DNA來自癌症患者的腫瘤細胞，2005年，通過分析循環DNA檢測突變的第一個臨床研究完成，隨後大量研究開展。不同的腫瘤中，大多數卵巢癌、肝癌以及胰腺、膀胱、結腸，胃、乳房、肝臟、食管、頭部和頸部腫瘤，神經母細胞瘤、黑素瘤可檢測到的ctDNA。相比之下，不到50%的腎母細胞瘤患者或發生轉移的腎臟、前列腺或甲狀腺癌症，以及不到10%的膠質瘤患者可檢測到ctDNA。

循環遊離DNA通常是以蛋白質複合體形式存在的DNA雙鏈片段，大小為180～10000 bp，從小碎片到大片段差異較大，因此其在血液中的半衰期也不盡相同。範圍從10min至2 h不等。ctDNA的含量與腫瘤負荷有關，不同病史的個體間差異也很大。隨著腫瘤進展，血漿ctDNA的含量會增加，晚期腫瘤患者或腫瘤轉移患者的ctDNA含量比早期腫瘤患者高。ctDNA總水平和突變水平與腫瘤負荷呈正相關。

ctDNA臨床應用前景有以下幾點：癌症檢測（篩查或早期診斷），分子譜或預後，檢測疾病殘留，監測療效，監測克隆進化。定量分析（疾病分期、療效監測、預後）。基因組分析，突變分析，治療推薦，監測克隆進化等。

二、ctDNA的檢測

理論上，所有檢測基因組信息的手段都可以檢測ctDNA，但是由於以sanger測序為代表的一代測序方法檢測敏感性不高，長久以來一直限制著ctDNA檢測的發展。隨著二代測序技術的出現，使ctDNA的檢測成為可能。ctDNA檢測最好的方法是全基因組測序，其優點為廣泛適用，缺點為所需費用較高。

三、ctDNA在乳腺癌中的應用

關於乳腺癌ctDNA的研究，可以追溯到1977年，Leon等人發現乳腺癌患者的血液中遊離DNA水平顯著上升，通過放射免疫檢測法他們檢測到這些遊離DNA範圍在0~2 000 ng/mL間波動。

此後，大量乳腺癌的ctDNA臨床應用的文獻被報道，這些應用主要集中在ctDNA與腫瘤負荷監測、藥物療效預測、複發轉移風險評估、早期診斷及預後分析等方面。

ctDNA在乳腺癌中的應用包括：腫瘤負荷監測、藥物療效預測、複發轉移風險評估、早期診斷及預後分析等。

1.腫瘤負荷監測：ctDNA是監測晚期BC腫瘤負荷敏感、特異的生物標誌物。Dawson等動態監測了30例晚期乳腺癌患者的ctDNA、循環腫瘤細胞(circulatingtumor cell，CTC)和CA15-3水平。結果顯示：

①與CA15-3、CTC相比，在治療期間患者特異性ctDNA水平變化具有更高的敏感性和特異性；

②ctDNA水平變化與療效相關性最強，ctDNA水平的增高平均能早於臨床影像檢查5個月提示疾病進展。

研究提示了對於晚期乳腺癌患者，ctDNA是監測腫瘤負荷敏感、特異的生物標誌物，其水平變化提示腫瘤負荷變化從而反映藥物療效。在臨床療效評價不確定如疾病穩定，或是病灶分離情況出現時，ctDNA檢測可能更有優勢。

研究發現，ctDNA敏感性優於CA15-3，納入30例PIK3CA或TP53突變或結構變異的晚期BC，收集141例血液樣本，結果顯示：ctDNA敏感性達96%（26/27），優於CA15-3的78%（21/27）。ctDNA敏感性也優於CTC，ctDNA敏感性達97%（29/30），優於CTC的87%（26/30）。ctDNA水平變化與療效相關性最強，且ctDNA水平的增高平均能早於臨床影像檢查5個月提示疾病進展。研究中53%（10/19）的疾病進展患者平均於臨床影像檢查5個月前檢測出ctDNA升高，提示疾病進展。

對於早期乳腺癌患者，ctDNA的檢測同樣能提示腫瘤的負荷。Tangvarasittichai等研究了ctDNA水平與乳腺癌臨床分期間的關係，發現Ⅱ~Ⅳ期患者ctDNA濃度顯著高於術後患者和健康對照組，並且腫塊大小、TNM分期、遠處轉移與ctDNA濃度是顯著相關的。

另外，一項研究入組了87例接受新輔助治療的乳腺癌患者，分別在新輔助治療前、治療後和術後1年監測ctDNA的甲基化(met-ctDNA)。結果顯示，新輔助療後的met-ctDNA與殘留腫瘤負荷顯著相關(P=0.008)。

新輔助治療前、治療後和術後1年監測ctDNA甲基化研究結果顯示：：Met-ctDNA在監測NAC治療效果方面，比CEA和CA15-3更為敏感；並且在監測預測腫瘤複發方面具有潛在作用。

2.藥物療效預測：Stoetzer等發現，新輔助化療不敏感組患者治療前cfDNA顯著高於治療獲益的患者。提示治療前cfDNA水平可能預測新輔助化療獲益程度。對Ⅲ期NeoALTTO試驗的HER2擴增病例進行ctDNA檢測，結果顯示伴隨PIK3CA或p53突變的HER2陽性乳腺癌，在抗HER2新輔助治療前，ctDNA檢出可能意味著更低的pCR率。納入15例乳腺癌患者，連續採集血液樣本測定ctDNA水平和突變情況。結果顯示：2例患者接受第1個周期新輔助化療（NAC）之後ctDNA突變拷貝數消失，並獲得了病理完全緩解（pCR）；ctDNA突變拷貝數總量與殘留腫瘤體積（MRI結果）相關。Guttery等檢測48例激素受體陽性晚期乳腺癌患者cfDNA的ESR1突變情況，初步探索了利用cfDNA技術預測乳腺癌內分泌治療耐葯的可行性。Murtaza等利用全外顯子測序技術檢測ctDNA用於獲得性耐葯預測的可行性。結果發現6個與不同藥物耐葯相關的基因突變，該研究首次證明全外顯子測序技術檢測ctDNA提早預測治療耐葯發生的可行性。cfDNA檢測技術評估部分患者HER-2基因擴增尚待進一步研究。

3.複發轉移風險評估：目前認為，晚期乳腺癌是不可治癒的，原因可能與臨床診斷滯後相關。因此尋找早期、特異的指標檢測微小轉移灶，預測複發轉移風險對於治癒腫瘤十分重要；既能通過治療提早干預臨床轉移灶的出現，又能避免部分術後治癒的患者接受過度的輔助治療。Olsson等通過全基因組測序篩選出20例乳腺癌患者原發灶可信的特異腫瘤相關染色體重排，之後採用高度敏感的微滴數字PCR方法，連續監測這20

例輔助治療階段患者循環血與原發灶中相同的特異性DNA的重排情況，發現其預測複發轉移敏感變為89%，且平均早於臨床複發轉移11個月。首次證明了ctDNA用於乳腺癌複發風險監測的可能性。

4.早期診斷：早期診斷是降低乳腺癌死亡率的最重要方法之一。現行篩查手段主要依靠影像學方法，但影像學檢查的解析度有限，有時難以區分良惡性，並且難以實現群體間的篩查。cfDNA檢測因取樣方便、檢測結果判讀客觀可能成為乳腺癌早診篩查的有力工具。

Gong等分析了乳腺良、惡性疾病患者、健康者cfDNA濃度，ROC曲線分析結果提示cfDNA用於診斷3組人群的特異性均大於0.9，提示cfDNA濃度的檢測能夠用於早期診斷。

Xi Wu等對分析了乳腺癌和健康女性血漿cfDNA端粒重複序列水平的差異，提示乳腺癌患者cfDNA端粒重複序列減少。

一項關於ctDNA甲基化的研究納入了749例早期乳腺癌、良性疾病和健康者，僅檢測6個基因的甲基化情況診斷乳腺癌的特異性和敏感性分別達到78.1%和82.4%，提示血漿中的表觀遺傳學的生物標誌物具有潛在診斷價值。

Uehiro對cfDNA表觀遺傳學進行檢測，也證實了血漿中的表觀遺傳學的生物標誌物對於乳腺癌早期識別具有診斷價值。

另外，ctDNA端粒重複序列減少可提示早期乳腺癌。cfDNA的表觀遺傳學檢測從健康女性中識別乳腺癌患者準確度高；可與乳房X射線一樣，用於早期乳腺癌患者的識別。

5.預後分析：Meta分析結果提示高水平的cfDNA和ctDNA與實體瘤患者的不良預後顯著相關。除近期的meta分析結果外，Madhavan等通過定量PCR方法檢測了晚期乳腺癌患者cfDNA完整性及水平，結果顯示cfDNA完整性與水平都能預測晚期乳腺癌無進展生存期(progression-freesurvival，PFS)和OS。

Dawson等的結果提示乳腺癌患者ctDNA水平與預後密切相關，含量越高5年生存率越低。

但是，與上述研究結果不一致的是Madic等納入40例三陰性乳腺癌患者，採用NGS平台檢測26例腫瘤組織存在TP53體細胞突變，並且在21例匹配的血樣樣本中檢測相同TP53突變即ctDNA，結果並未發現這21例患者ctDNA的水平與疾病進展時間(time toprogression，TTP)和總生存期(overallsurvival，OS)的相關性。

目前關於ctDNA的預後價值尚存在爭議，各實驗室間的結論並不一致，原因可能是多方面的，包括樣本處理、操作規範、DNA提取、檢測技術、入組人群等差異。

隨著精準醫療概念的提出，乳腺癌診療將從個體化走向精準；以基因檢測為代表的精準診斷模式，將會是未來乳腺癌精準診療的重要組成部分。ctDNA檢測技術的發展正是邁向精準診斷重要的一步。但目前該領域研究仍處於起步階段，ctDNA研究還處於科研階段，其臨床應用仍然任重道遠。

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