CRISPR/Cas9改變了些什麼？你有知道嗎？

CRISPR/Cas系統是細菌和古菌特有的一種天然防禦系統，用於抵抗病毒或外源性質粒的侵害。當外源基因入侵時，該防禦系統的CRISPR序列會表達與入侵基因組序列相識別的 RNA，然後CRISPR相關酶(Cas)在序列識別處切割外源基因組DNA，從而達到防禦目的。

CRISPR/Cas自誕生以來，迅速發展，已經成為生命科學領域最耀眼、最有前景的技術。尤其在近兩年，CRISPR/Cas相關新進展新突破不斷湧現。那我們就帶大家來看看吧~

基因編輯技術的發展史

基因編輯可以分為三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。這三個基因編輯技術都利用了DNA修復機制。

CRISPR/Cas技術的介紹

CRISPR/Cas9系統的發現

1、1987年，在大腸桿菌的基因組中首次發現了一個特殊的重複間隔序列——CRISPR序列，隨後，在其他細菌和古菌中也發現了這一特殊序列。

2、2005年，發現這些CRISPR序列和噬菌體的基因序列匹配度很高，說明CRISPR可能參與了微生物的免疫防禦。

3、2011年，CRISPR/Cas系統的分子機制被揭示：當病毒首次入侵時，細菌會將外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的間隔區；病毒二次入侵時，CRISPR轉錄生成 前體crRNA(pre-crRNA)， pre-crRNA經過加工形成含有與外源基因匹配序列的crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識別後，介導Cas蛋白結合併切割，從而保護自身免受入侵。

4、2013年，發現CRISPR/Cas9系統可高效地編輯基因組。隨後張鋒等使用CRISPR系統成功的在人類細胞和小鼠細胞中實現了基因編輯。

CRISPR/Cas技術的原理

CRISPR/Cas9系統的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA）通過鹼基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結合形成tracrRNA/crRNA複合物，此複合物引導核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。而通過人工設計crRNA和tracrRNA這兩種RNA，改造成具有引導作用的sgRNA（single guide RNA），從而引導Cas9對DNA的定點切割。

CRISPR/Cas技術的優勢

設計簡單，簡明的鹼基互補設計原則，識別不受基因組甲基化影響，能靶向幾乎任意細胞任意序列，方便同時靶向多個靶點，切割效率高。

CRISPR/Cas的脫靶效應

PAM (Protospacer adjacent motif )

PAM序列區是CRISPR/Cas9系統行使切割功能的基本條件。如果靶序列 3′端沒有PAM序列，即使靶序列與sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不會切割該序列位點。 PAM序列主要影響CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在細胞水平上，NGG介導的切割效率是最高的。

sgRNA (Single guide RNA )

sgRNA與目標基因組相結合的20nt序列區決定著CRISPR/Cas系統的靶向特異性。CRISPR/Cas9與靶位點識別的特異性其實主要依賴於sgRNA與靠近PAM區的10~12 bp的鹼基配對，而其餘遠離PAM序列 8~10 bp 鹼基的錯配對靶位點識別的影響並不明顯。目前研究結果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是決定特異性的關鍵，其他序列也均在不同程度上影響脫靶效應。

CRISPR/Cas9的脫靶效應給研究帶來了一定程度上的不確定性，也是限制其發揮更大潛力的主要原因之一。

展望

近幾年CRISPR/Cas基因編輯技術飛速發展，推廣應用到了生物、醫學、農業以及環境等多個領域，造就了一批批科研奇蹟，尤其是在遺傳病的治療、疾病相關基因的篩查與檢測、腫瘤治療以及動植物的改造、病原微生物防治等領域有著巨大的潛力，也將深遠地影響整個世界。

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