Nature Letter系統分析1699例兒童白血病和實體瘤基因組和轉錄組

http://www.nature.com/articles/nature25795

泛癌分析是指對多種類型癌症系統分析其分子異常，確定不同細胞來源癌症中重要的異常生物學進程的共性和差異。泛癌分析已用於成年人癌症分析1-3，然而，在兒童癌症分析中尚未見報道。來自美國聖裘德兒童研究醫院的Jinghui Zhang課題組對六種不同類型的1699例兒童白血病和實體瘤進行全基因組測序、全外顯子測序和轉錄組測序，並系統分析單核苷酸突變（single nucleotide variants，SNVs）、插入缺失（small insertions or deletions，indels）、結構突變（structural variations，SV）拷貝數改變（copy number alterations，CNAs）和內部串聯重複（internal tandem duplications，ITDs）等體細胞突變。該研究提供了全面的兒童癌症基因組結構，強調兒童癌症精確治療的特殊發展需要。

一、實驗設計及分析流程

1、樣品收集

分別從1699例兒童腫瘤病人中收集配對的正常組織和腫瘤組織，具體分類如下：

（1）B系急性淋巴細胞性白血病（B-lineage acute lymphoblastic leukaemias，B-ALL）：689例；

（2）T系急性淋巴細胞性白血病（T-ALL）：267例；

（3）急性髓系白血病（acute myeloid leukaemias，AML）：210例；

（4）神經母細胞瘤（neuroblastomas，NBL）：316例；

（5）Wilms瘤（Wilms tumours，WT）：128例；

（6）骨肉瘤（osteosarcomas，OS）：89例。

綜上，分別收集六種不同類型的兒童腫瘤，其中98.5%病人年齡低於20歲。

2、主要測序技術

（1）全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）

（2）全外顯子測序（whole-exome sequencing，WES）：利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區域DNA捕捉並富集後進行高通量測序的基因組分析方法；

（3）轉錄組測序（transcriptome sequencing）：RNA-seq。

3、數據分析

分析流程如圖1所示，在完成測序後，首先對測序結果進行質控，具體分析如下：

（1）全基因組測序分析：從TARGET Data Matrix資料庫下載SNVs、indels和結構突變等突變注釋文件比對分析；

（2）全外顯子測序分析：使用Bambino程序檢測體細胞體細胞SNVs和indels4；

（3）RNA-seq數據分析：使用StrongArm匹配測序數據，通過CICERO確定RNA融合5。

圖1.數據分析流程圖

最終，該研究小組在兒童腫瘤中確定了142個驅動基因，其中45%與成人癌症相匹配；此外，CNAs和SV在體細胞突變中佔62%。

二、實驗結果

1、體細胞突變率及特點

（1）如圖2a和2b所示，體細胞突變率中位數在兒童腫瘤中較低，由0.17/Mb（AML）至0.79/Mb（OS），而在成人癌症中是1-10/Mb6；

（2）如圖2c和2e所示，兒童腫瘤中有11種突變類型（T1~T11），T10和T11是新發現的體細胞突變，伴隨著低的等位基因突變率（＜0.3），分別在WT和AML中較多；

（3）在不同的兒童腫瘤體細胞突變中，T1和T4（clock-like endogenous mutational processes）佔比最高：T-ALL (97%)、AML (63%)、B-ALL (36%)和WT（28%）。

圖2.體細胞突變率及特點

2、腫瘤驅動基因篩選及特點

該研究在兒童腫瘤中確定了142個顯著突變的驅動基因，並列舉了前100個基因，如圖3a所示，其中CDKN2A突變率最高，在T-ALLs、B-ALLs和OS中分別為78%、42%和11%。此外，兒童腫瘤驅動基因具有一定的特點，如下，

（1）該研究發現的78（＞50%）個驅動基因是成人泛癌研究未曾發現的；

（2）在白血病和NBL中，40%~50%點突變具有較低的等位基因突變（＜0.3），暗示亞克隆突變促進兒童腫瘤發生；

圖3.兒童癌症中候選驅動基因

（3）同一基因突變具有不同類型，如STAG2，有5種不同的體細胞突變，SNVs、indels、CNAs、ITDs和SV；

（4）如圖3b所示，兩個突變基因間存在共存和互斥的關係，該研究發現新的配對基因，如ETV6和IKZF1在AML中共存，而SHANK2和MYCN在NBL中互斥。

3、解析體細胞突變及相關的生物學進程

該研究中使用了WGS和WES分析體細胞突變，如圖4a所示，其中輕灰指點突變，深灰指CNAs或SV，黑色值指點突變及CNAs或SV，兩者檢測出的點突變是高度一致的，但WGS更能檢測齣兒童腫瘤中CNAs和SV。本研究共發現了與兒童腫瘤發生相關的21條生物學通路，如圖4b和4c，其特點如下：

（1）不同類型兒童腫瘤間存在相同的生物學通路異常，如細胞周期和表觀調控；

（2）有些生物學通路存在組織特異性，如JAK-STAT、Wnt/β-catenin和NOTCH信號通路；

（3）不同類型兒童腫瘤間相同生物學通路突變的基因不同，如RAS，JAK-STAT和PI3K信號通路，ALK、NF1和PTEN主要在實體瘤中發生突變，幾乎所有的FLT3、PIK3CA、PIK3R1和RAS突變在白血病中都存在；

圖4.兒童腫瘤中體細胞突變相關生物學進程

此外，許多生物學進程在兒童腫瘤與成人腫瘤都是異常，其影響基因既具有相同性，如細胞周期基因和表觀調控基因，也具有特異性，如轉錄因子和JAK-STAT信號通路基因是兒童腫瘤特異的。

4、 突變等位基因表達分析及特點

突變等位基因表達檢測能有效評估基因產物作用，為揭示等位基因表達失衡的表觀調控提供了可能。該研究通過比對WGS和RNA-seq數據分析不同類型兒童腫瘤中6959個編碼突變，發現這些突變中34%是等位基因突變，如圖5所示，其特點如下：

（1）突變等位基因表達與DNA MAF高度相關；

（2）多數（76%）截斷突變抑制突變等位基因表達，但多數（87%）熱點突變促進突變等位基因表達；

（3）等位基因特異性表達分析不能有效檢測亞克隆雜合性缺失，可採用單細胞測序技術解決，如，在不同的亞克隆細胞中發現分別WT1 D447N和11p LOH。

圖5.等位基因表達分析

三、討論和展望

該研究聯合WGS、WES和RNA-seq對1699例兒童腫瘤進行泛癌分析，同時應用單細胞測序技術有效檢測亞克隆雜合性缺失，這一大數據分析為我們提供了一份詳盡的兒童腫瘤基因組圖譜，不僅為臨床研發兒童腫瘤專用藥物奠定了分子基礎，而且為基礎研究兒童腫瘤的分子機制指明了方向。

該研究發現表觀遺傳生物學通路的發生率在T-ALL、B-ALL、AML、NBL、WT和OS中分別為53.7%、38.7%、34%、17.6%、12.3%和47.4%，這提示我們表觀遺傳在兒童白血病和實體瘤中起著重要作用；此外，在Top 100 候選的驅動基因中，PHF6（13/100）、KMT2A（14/100）、KMT2D（28/100）和SETD2（34/100）等組蛋白修飾相關基因排名靠前，提示我們組蛋白修飾在兒童腫瘤發生中扮演重要角色，未來可通過ChIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）解析兒童腫瘤中染色體組蛋白甲基化、乙醯化和泛素化等修飾7，為精準醫療提供理論依據。

參考文獻

Kandoth, C. et al. Mutational landscape and significance across 12 major cancer types.Nature502, 333-339 (2013).

Leiserson, M.D. et al. Pan-cancer network analysis identifies combinations of rare somatic mutations across pathways and protein complexes.Nat Genet47, 106-14 (2015).

Lawrence, M.S. et al. Discovery and saturation analysis of cancer genes across 21 tumour types.Nature505, 495-501 (2014).

Edmonson, M.N. et al. Bambino: a variant detector and alignment viewer for next-generation sequencing data in the SAM/BAM format.Bioinformatics27, 865-6 (2011).

Zhang, J. et al. Germline Mutations in Predisposition Genes in Pediatric Cancer.N EnglJ Med373, 2336-2346 (2015).

Alexandrov, L.B. et al. Signatures of mutational processes in human cancer.Nature500, 415-21 (2013).

Park, P.J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.Nat Rev Genet10, 669-80 (2009).

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！