基因編輯技術在醫學應用中大顯身手

知識 03-20

基因編輯技術，圖片來自genome-engineering.org

編者按

自2012年，第三代基因技術CRISPR/Cas9被發明以來，它已在全球各地分子生物實驗室里廣泛地應用。基於該技術可精準地靶向目標基因進行精確地修飾，我們可以將其應用於疾病的動物模型構建、由點突變引起的疾病的治療，我們甚至還可以利用該工具對胚胎細胞的基因進行精確地編輯。CRISPR/Cas9將在醫學應用發揮巨大的作用。本系列文章由上海科技大學生命科學與技術學院劉冀瓏教授主持策劃。本系列上一篇文章請見《基因編輯技術CRISPR的發展簡史：從發現到爆炸》

撰文 | 劉奕、王俏琦、張波、章元兵、張子恆、周爽＊（上海科技大學生命科學與技術學院）

責編 | 葉水送

知識分子為更好的智趣生活ID：The-Intellectual

基因編輯技術不斷發展，到現在已發展到第三代基因編輯技術。第三代基因技術CRISPR/Cas克服了傳統基因操作的周期長、效率低、應用窄等缺點。作為一種最新湧現的基因組編輯工具，CRISPR/Cas能夠完成RNA導向的DNA識別以及編輯。通過一段序列特異性嚮導RNA分子（sequence- specific guide RNA）引導核酸內切酶到靶序列處，從而完成基因組的精確編輯，因其操作簡單、成本低、高效率，近幾年成為炙手可熱的基因編輯手段，目前已廣泛用於模式生物研究，醫療，植物作物，農業畜牧等領域。

1 磨快CRISPR利器，加快科學發現

CRISPR/Cas9的出現給了科研人員無限想像的可能，基於CRISPR/Cas9的技術很快就被廣泛應用於全世界各個實驗室中，這裡我們將主要介紹最常用的幾種應用。

早期，科研人員通過同源重組（HR）介導的基因打靶技術來實現基因編輯，但因效率太低，極大地限制了其應用。為了克服這一難題，一系列通過核酸內切酶介導的基因編輯技術被開發出來，通過這些核酸內切酶切割特定的基因組序列，藉助細胞自身修復體系如非同源末端連接或同源重組修復方式，並由此達到改變基因組序列的目的，鋅指核酸內切酶（ZFNs）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）以及sgRNA介導的Cas9核酸內切酶正是基於此原理工作的。

鋅指核酸內切酶（ZFNs）和類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）均可通過蛋白-DNA相互作用識別基因組上的特定DNA序列並完成特定位點的切割，但是它們因效率低下、可選潛在位點少、成本高等原因極大地限制了它們的應用，直到CRISPR/Cas9系統的出現，科研人員才找到了一種成本低、效率高、簡單易用的基因編輯工具。

CRISPR/Cas9出現之後，科研人員最先想到的便是將其運用到基因編輯上了，根據目標基因的外顯子序列設計single guide RNA（sgRNA）並與含有Cas9編碼序列的質粒一起轉入細胞，sgRNA通過鹼基互補配對的原則引導Cas9蛋白靶向目標DNA序列，Cas9蛋白會在該位點切割DNA，引發DNA雙鏈斷裂（DSB），此時細胞通過非同源末端連接修復（NHEJ）完成DNA的自身修復，因修復過程中常常發生鹼基的添加和丟失，而最終導致基因的移碼突變從而達到基因敲除的目的，或者針對目的基因的上下游序列各設計一個sgRNA，從而引發該基因上下游同時發生DSB，再通過DNA損傷修復機制將斷裂的上下游兩端的DNA連接在一起，引發DNA片段缺失，從而達到基因敲除的目的。如果在此基礎上為細胞引入一個修復的模板質粒，細胞就會以此模板進行同源重組修復，如果引入的修復模板是一個想要插入的基因，便可在特定的位置進行基因敲入了。

2 神奇的dCas9多功能工具包

隨著人們對Cas9研究的不斷深入，Cas9發揮功能的結構基礎也漸漸明確，在Cas9發揮切割DNA的功能時，它的兩個結構域發揮著重要作用，分別是RuvC和HNH，其中HNH結構負責sgRNA互補鏈的切割，切割的位點位於PAM的5"端的第三個鹼基外側，RuvC結構域負責非互補鏈的切割，切割位點是在PAM上游的3-8鹼基之間，當將這二者同時突變失活，便產生了失去DNA切割活性的Cas9蛋白了（dCas9），dCas9雖然失去了對DNA的切割能力，但依舊可以在sgRNA的引導下到達指定的DNA序列處，這是基於sgRNA–dCas9複合體的這一特徵，若在dCas9上融合不同功能的結構域，便可在特定的DNA區域完成不同的修飾了，這便形成了基於CRISPR/dCas9的工具包了。

腦洞大開的科學家利用dCas9蛋白，開發出各種用途的工具，可謂是把CRISPR/dCas9利用得淋漓盡致，這裡我們舉幾個簡單的例子如研究人員針對目標基因的啟動子序列設計sgRNA，使得sgRNA–dCas9複合體靶向結合到目標基因的啟動子上，因dCas9蛋白帶來的空間位阻可干擾轉錄因子的結合，從而引發在轉錄水平上的干擾基因表達的效果，而在此基礎上為了達到更佳的干擾效果，一些能夠引發基因轉錄阻遏的結構域也被融合到dCas9蛋白上，如KRAB（Krüppel-associated box）等。

既然可以通過CRISPR/dCas9實現基因表達的干擾，那是不是也可以通過CRISPR/dCas9實現激活基因表達呢？答案是肯定的。科研人員通過向dCas9上融合vp64（四個串聯的vp16）、p65AD（p65 activation domain）等促進促進基因轉錄的結構域，實現基因的內源性激活，在經過各種優化之後，比如由vp64、p65AD和VPR（Epstein-Barr病毒R反式激活因子Rta47）組成的三聯結構域（dCas9–VPR）就可以實現很高水平的內源性激活基因表達的效果了。

通過基於CRISPR/dCas9的基因表達干擾和內源性激活工具的建立，使得科研人員在進行諸如基因功能研究的工作時有了更為簡單、高效且低成本的研究工具。這很大程度上為科研人員節約了時間和成本。

3 精準編輯表觀遺傳修飾

表觀遺傳研究是近些年來非常火熱的領域，DNA甲基化、組蛋白乙醯化等都在生物體中發揮著重要的生物學功能，而CRISPR/dCas9在表觀遺傳的研究中也成為了十分強大的工具。比如CRISPR/dCas9介導的靶向DNA甲基化修飾，我們知道在DNA甲基化過程中DNA甲基轉移酶（DNA methytransferases，DNMTs）起著關鍵的催化作用，而且大部分DNA甲基化都發生在CpG島，因此研究人員嘗試著將DNMTs的催化結構域融合到dCas9上形成dCas9-Dnmt3a3L，並通過sgRNA的引導靶向目標DNA序列的CpG附近催化其甲基化，以實現DNA甲基化的定點編輯。相似地，研究人員將在DNA去甲基化過程中起關鍵催化作用的TET1蛋白的催化結構域融合到dCas9上形成dCas9-TET1，同樣的通過sgRNA的引導靶向目標DNA序列的CpG附近，可以實現去甲基化修飾。

再如CRISPR/dCas9介導的靶向組蛋白修飾，與靶向DNA甲基化修飾相似，一些和組蛋白修飾相關的酶包括組蛋白去甲基化酶（LSD1/KDM1A）、組蛋白乙醯轉移酶以及組蛋白甲基轉移酶等也被融合到dCas9蛋白上，以實現靶向組蛋白修飾。

除以上的應用外，CRISPR/dCas9還被用於其他多個領域，比如將EGFP融合到dCas9上，通過sgRNA靶向特定DNA序列實現基因組成像。此外，還有研究人員開發出基於CRISPR/dCas9的enChIP技術，以來探測特定基因組區域上的DNA-蛋白質相互作用，通過sgRNA靶向特定基因組基因座的標記dCas9的抗體免疫沉澱，之後通過蛋白質譜（enChIP-MS），鑒定與之特異性相互作用的蛋白質。這些工具的開發都極大地幫助了科研人員，使得之前無法實現的操作成為可能，推動了生命科學的快速發展。

4 基因及藥物靶標基因的確定

以往基於ZFN或TALENs的基因組編輯技術，需要針對DNA靶序列設計蛋白質，而CRISPR技術僅需要根據不同的靶序列合成相應的80nt左右的sgRNA來引導Cas9蛋白對序列進行修飾，這就實現了基因編輯技術的高通量應用。

CRISPR全基因組篩選技術可用於必需基因及藥物靶標基因鑒定。多倫多大學Jason Moffa研究組建立了覆蓋全基因組gRNA庫並在5個細胞系中逐個敲除了1.8萬個基因，最後鑒定出在不同細胞系間保守的1580個必需基因構成的「core fitness genes」。同樣，美國達納-法伯癌症研究所W. Nick Haining研究組通過CRISPR/Cas9系統性地敲除了黑色素瘤細胞的2368個基因，發現ptpn2基因缺失會使這些癌細胞對PD-1阻斷更加敏感。華盛頓大學醫學院Michael Diamond研究組利用CRISPR/Cas9鑒定在宿主細胞中堅定了黃病毒感染所絕對必需的9個基因，其中spcs1基因缺失時，不僅降低黃病毒感染率，而且對細胞也不產生副作用，這將是一個潛在的黃病毒藥物靶標。

5 疾病建模及器官供體產生

CRISPR/Cas9作為新一代基因編輯技術，同樣可被應用於建立疾病模型及培育供體器官。基因治療可實現在患者自身細胞中糾正遺傳缺陷，並結合其他生物學技術在體外培育出組織特異性的「類器官」，對於疾病建模、藥物篩查及臨床治療等方面研究有極大意義。CRISPR介導的基因組編輯技術可以直接應用於非人類哺乳動物的疾病模型建立，將更有利於疾病致病機理和治癒研究。

此外，CRISPR技術還可應用於大型動物的基因編輯以研究免疫排斥及跨物種的疾病傳染，從而解決異種移植器官來源的瓶頸，豬被認為是人體異種器官來源的首選動物，而目前豬器官用於人類的主要障礙為免疫排斥反應，及豬內源性逆轉錄病毒（Porcine endogenous retroviruses, PERVs）帶來的醫療風險問題。eGenesis公司楊璐菡博士與哈佛大學George Church教授利用CRISPR進行基因改造一步讓62個PERV pol 基因關閉，因而將來自PERV的傳染風險降低了三個數量級，成功培育出不含PERVs的豬品系，作為安全有效的異種移植器官來源，這些研究讓豬成為病人的器官來源更有前景。

6 基因療法

基因編輯技術可以準確地改造人類基因，達到基因治療效果。中國科學院生物化學與細胞生物學研究所李勁松研究組通過在小鼠胚胎中注射CRISPR/Cas9糾正白內障小鼠模型中的遺傳缺陷，所產生的後代是可育的並能將修正後的等位基因傳遞給它們的後代。杜氏肌營養不良（DMD）是一種罕見的肌肉萎縮症，也是最常見的致命性遺傳病之一，是由肌營養不良蛋白dystrophin基因突變引起。杜克大學Charles Gersbach研究組應用CRISPR/Cas9在DMD小鼠中將dystrophin基因突變的23外顯子剪切，而合成了一個截短的但功能很強的抗肌萎縮蛋白，這是生物學家「首次成功地利用CRISPR基因編輯技術治癒了一隻成年活體哺乳動物的遺傳疾病」。

CAR-T治療簡圖，圖片來自onclive.com

基因編輯技術聯合免疫療法在腫瘤及HIV/AIDS治療具有廣泛的應用前景。嵌合抗原受體T細胞（Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T）細胞治療是非常有前景的腫瘤治療方法。CAR-T細胞療法在B細胞惡性血液腫瘤治療中已經取得碩果。中科院動物研究所王皓毅研究組利用CRISPR/Cas9技術在CAR-T細胞中進行雙基因（TCRα subunit constant 和beta-2 microglobulin）或三基因（TRAC，B2M及programmed death-1）敲除。美國斯隆凱特林癌症紀念中心Michel Sadelain研究組發現CRISPR/Cas9技術將CAR基因特異性靶向插入到細胞的TRAC基因座位點，極大增強了T細胞效力，編輯的細胞大大優於傳統在急性淋巴細胞白血病小鼠模型中產生CAR-T細胞。

繼諾華的Kymriah以及Gilead （kite Pharma）的Yescarta接連上市，CRISPR Therapeutics公司也在應用CRISPR/Cas9基因編輯技術開發同種異體CAR-T候選產品。2016年10月，四川大學華西醫院的腫瘤醫生盧鈾領導的一個團隊首次在人體中開展CRISPR試驗，從晚期非小細胞肺癌患者體內提取出免疫細胞，再利用CRISPR/Cas9技術剔除細胞中的PD-1基因更有助於激活T細胞去攻擊腫瘤細胞，最後將基因編輯過的細胞重新注入患者體內。

7 致病菌及抗病毒研究

微生物種群與人體醫學，自然環境息息相關。北卡羅來納大學Rodolphe Barrangou與Chase L. Beisel合作通過使用基因組靶向CRISPR/Cas9系統可靶向並區分高度密切相關的微生物，並程序性去除細菌菌株，意味著CRISPR/Cas9系統可開發成精細微生物治療體系來剔除有害致病菌，人類將有可能精確控制微生物群體的組成。以色列特拉維夫大學Udi Qimron將CRISPR系統導入溫和噬菌體中在侵染具有抗生素抗性的細菌以消滅此類細菌，CRISPR系統已具有成為新一類抗生素的潛力。Locus BioSciences公司也在開發在噬菌體中開發CRISPR系統以達消滅難辨梭菌的目的。

弗吉尼亞理工大學Zhijian Tu研究組在雄蚊子中進行M因子基因編輯，可以導致雌雄蚊之間的轉化或雌蚊的殺戮，從而實現有效的性別分離和有效減少蚊子的數量，也將減少寨卡病毒及瘧疾等傳播。

基於CRISPR治療不僅可以應用於根除共生菌或有益菌群的病原體，也可應用於靶向人類病毒，包括HIV-1，皰疹病毒，乳頭瘤病毒及乙型肝炎病毒等。具有純合的32-bp缺失（Δ32）的CC趨化因子受體5型（CCR5）基因的患者對HIV感染具有抗性。因此加利福尼亞大學Yuet Wai Kan在誘導多能幹細胞iPSC中利用CRISPR系統引入純合CCR5Δ32突變後，誘導分化後的單核細胞和巨噬細胞對HIV感染具有抗性。天普大學Kamel Khalili 課題組應用CRISPR/Cas9系統在宿主細胞基因組中精確編輯HIV-1 LTR U3區，從而在將艾滋病病毒從基因組中剔除。

8 核酸診斷及細胞事件記錄

Cas12a （Cpf1）屬於CRISPR家族另一核酸內切酶，它也可被gRNA引導並剪切DNA。但是，它不僅可以切割相結合的單鏈或雙鏈DNA，也剪切其他的DNA。近日，加州大學伯克利分校Jennifer Doudna研究組開發了基於CRISPR的一項新技能——基因偵探（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR)）。利用單鏈DNA將熒光分子和淬滅分子連接構建成一個報告系統，當CRISPR-Cas12a在gRNA引導下結合到目標DNA並發揮剪切作用時，報告系統中的DNA也被剪切，熒光分子將被解除抑制。此系統在致癌性HPV的人的DNA樣品檢測HPV16和HPV18變現極佳。

布羅德研究所Feng Zhang研究組開發的基於CRISPR的2代SHERLOCK （Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），原理是利用Cas13a被激活後，可以切割除靶序列外其他的RNA的特徵，引入了解除熒光分子的抑制。此工具可實現一次性多重核酸檢測，可同時檢測4種靶標分子，額外添加的Csm6使得這種工具比它的前身具有更高的靈敏度，並將它開發成微型試紙條檢測方法，簡單明了易操作，已被研究人員成功應用於RNA病毒，如登革熱病毒和寨卡病毒，及人體液樣本檢測。

Broad研究所David R. Liu研究組利用CRISPR/Cas9開發了一種被稱為CAMERA（CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus）的記錄細胞事件的「黑匣子」他們利用這個系統開發出兩種細胞記錄系統，在第一種被稱為「CAMERA 1」的細胞記錄系統中，研究人員利用細菌中質粒的自我複製但又嚴格控制其自身數量的特徵，將兩種彼此之間略有不同的質粒以穩定的比例轉化到細菌中，隨後在接觸到外來藥物刺激時，利用CRISPR/Cas9對這兩種質粒中的一種進行切割，通過對質粒進行測序並記錄兩種質粒比例的變化來記錄細菌接觸外來刺激的時間。另一種細胞記錄系統被稱為「CAMERA 2」，它利用基於CRISPR/Cas9的鹼基編輯系統實現在細胞內特定信號發生時改變遺傳序列中的單個鹼基，以此實現對諸如感染病毒、接觸營養物等刺激的記錄。這套技術的出現將很大程度的幫助人們進一步了解細胞的各類生命活動的發生髮展規律。

9人類胚胎基因組編輯

2015 年 4 月，中山大學的黃軍利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術，同源重組修復了胚胎中一個引發地中海貧血β-globin gene （HBB）的突變。