植生所王金博士等報道Cas12a對於靶標ssDNA和非靶標ssDNA的切割特性研究

BioArt按

大約一個月前，Jennifer Doudna實驗室在Science雜誌上發表了一項基於CRISPR-Cas12a的技術，用於檢測病毒DNA。他們的工作一經媒體報道就火遍了「朋友圈」。然而，國內有一個團隊做出了類似的工作，卻在2016年夏天投稿後被各種理由拒絕，之後輾轉於多個所謂的頂尖雜誌，甚至經過兩輪評審之後被reviewer認為沒有創新性而拒稿。令人欣慰的是，雖然國際上可能還存在某種無形的「偏見」，但Cell Research雜誌卻能慧眼識珠：該團隊的相關工作在早於Doudna實驗室一個月投稿的情況下最終被Cell Research雜誌接受，並於近日發表。為了使讀者更直觀地了解國內同行工作的重要意義以及投稿背後的心酸歷程，BioArt特別邀請到了熟知該項工作的中科院北京微生物研究所婁春波研究員進行點評，以饗讀者！

近年來，CRISPR領域的兩巨牛（張鋒和Doudna）都十分關注核酸檢測方向。張鋒團隊在RNA檢測方面做了很多工作，去年4月份發表在Science上的論文引爆網路【1】；而Doudna團隊藉助最近發表的這篇Science也必將強勢切入DNA的檢測領域【2】。CRISPR最初是因基因編輯能力而備受關注；但是在臨床應用方面，似乎基於CRISPR的核酸診斷會更容易實現些。

作為CRISPR/Cas9之外的另一個明星分子，Cas12a（舊稱Cpf1）也受到了廣泛關注【3】。和Cas9類似，Cas12a/crRNA複合物可以特異識別並切割靶標dsDNA，因此已被應用於多個物種的基因組編輯工作【4-8】。此外，Cas12a還擁有RNase活力以加工前體crRNA到成熟crRNA【9】；基於這一點，人們可以設計不同靶向的crRNA array，進而實現多靶點的基因組編輯【10,11】和多基因的轉錄調控【2,13】。不過，除了針對靶標dsDNA和前體crRNA的切割活力外，人們對Cas12a是否切割ssDNA的了解非常少。

3月12日，中科院上海植物生理生態研究所趙國屏院士團隊王金博士等在Cell Research雜誌上發表了題為CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA的研究論文，深入系統地研究了Cas12a對於靶標ssDNA和非靶標ssDNA的切割特性。

研究人員發現，Cas12a在靶標ssDNA的第22位附近特異切割DNA（作者稱為cis切割），並且該切割行為不需要PAM序列的輔助。另外，一旦Cas12a/crRNA與靶標DNA（雙鏈或者單鏈）形成三元複合體後，該複合物就會顯示出很強的trans切割活性，也就是將體系中任意ssDNA切成短片段。結合質譜分析，作者發現切碎的短片段大小為2-4個核苷酸。通過單氨基酸突變實驗，作者證明這種trans切割活性由Cas12a中的「RuvC催化口袋」負責完成，並提出了三元複合物行使ssDNA cis/trans切割活性的模型。BioArt從王金老師處獲悉，基於該原理，作者團隊也開發了核酸快速檢測體系，相關工作正在投稿中。

值得注意的是，這篇Cell Research的投稿比Jennifer Doudna實驗室的Science工作要早近1個月（該篇Cell Res是2017年10月30日投稿；而Science那篇則是2017年11月29日投稿，此外該文還同步post到預印本雜誌bioRxiv上）【12】；巧合的是，兩個團隊的工作於同一天被接收（2018年2月5日）。

在機理髮現方面：兩個團隊的主要結論以及所做的實驗工作幾乎一模一樣，但實際上Cell Research的工作看上去更加細緻、全面。不過，Doudna的Science工作中包含了「發現」和「應用」兩部分；王金博士團隊則將「發現」部分發表於Cell Research，而應用部分正在投稿。兩個團隊幾乎同時期、獨立地完成了Cas12a該活力的發現、鑒定和其應用的開發工作。

憑藉其快速、簡便、廉價等特性，基於CRISPR的核酸快檢技術有望在核酸市場中佔有一席之地。RNA和DNA的檢測雖然各有優缺點，但是DNA樣本會更加穩定，操作上也更簡便。張鋒團隊在RNA的檢測方面一騎絕塵；而在DNA的檢測方面，Doudna團隊已經明確表示會進一步開發DETECTR的後續應用，同時國內的王金博士也在聯合有關公司合作開發相關應用。可以預見，後續的競爭一定會是異常激烈的，請大家拭目以待。

專家點評

婁春波（中科院北京微生物研究所研究員，青年千人）

王金博士等報道的這種Cas12a-crRNA具有切割特異DNA靶序列後被激活非特異切碎單鏈DNA的活性，類似的現象之前被Zhang Feng等人在RNA靶向的Cas13a系統中報道過，但是DNA在穩定性等方面優越於RNA，更有利於技術優化和推廣。這是一個非常有趣的基礎科學現象，也是近幾年不斷挖掘CRISPR這樣微生物獲得性免疫系統中各式各樣奇特生物化學反應的一個重要成果。這個研究成果將來有希望應用於多種核酸檢測過程，比如腫瘤檢測、HIV等傳染性病原體檢測和食品安全檢測等。這個結果跟兩周前Science雜誌發表的Jennifer Doudna課題組的研究結果類似，但從投稿時間來看，王金博士的文章早投一個月。實際上，我本人在2017年9-10月份的一個會議上，就看到王金博士展示的實驗結果。當時他說這個工作已經歷了幾個雜誌的「投稿-拒稿」循環，而且被審稿人認為這種類似於Cas13a的RNA非特異切割活性的實驗結果沒有新意。然而正是這樣沒有「新意」的結果在半年後卻被發表於國際權威雜誌。除了文章寫作等問題外，相應的歧視現象應該還是存在的。

參考文獻：

1. Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Lee, J. W., Essletzbichler, P., Dy, A. J., Joung, J., ... & Feng, Z. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.Science, eaam9321.

2. Chen, J.S., et al., CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.Science, 2018.

3. Zetsche, B., et al., Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.Cell, 2015. 163(3): p. 759-71.

4. Hur, J.K., et al., Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.Nat Biotechnol, 2016. 34(8): p. 807-8.

5. Kim, D., et al., Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells.Nat Biotechnol,2016. 34(8): p. 863-8.

6. Ferenczi, A., et al., Efficient targeted DNA editing and replacement in Chlamydomonas reinhardtii using Cpf1 ribonucleoproteins and single-stranded DNA.Proc Natl Acad Sci U S A, 2017. 114(51): p. 13567-13572.

7. Jiang, Y., et al., CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum.Nat Commun, 2017. 8: p. 15179.

8. Mahfouz, M.M., Genome editing: The efficient tool CRISPR-Cpf1.Nat Plants, 2017. 3: p. 17028.

9. Fonfara, I., et al., The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.Nature,2016. 532(7600): p. 517-21.

10. Zetsche, B., et al., Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.Nat Biotechnol, 2017. 35(1): p. 31-34.

11. Wang, M., et al., Multiplex Gene Editing in Rice Using the CRISPR-Cpf1 System.Mol Plant, 2017. 10(7): p. 1011-1013.

12. Zhang, X., et al., Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.Cell Discov, 2017. 3: p. 17018.

13. Tak, Y.E., et al., Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.Nat Methods, 2017. 14(12): p. 1163-1166.

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