幹細胞治療肝臟疾病研究進

幹細胞基於其具有自我更新、高度增殖及多向分化的潛能，使得幹細胞基礎及轉化醫學研究成為當前國際上最受關注的領域之一，隨著幹細胞技術的不斷發展，幹細胞分離、培養、移植等方面取得了突破性進展，並應用于越來越多疾病的治療，包括中樞神經系統疾病、心肌損傷、骨關節炎、黃斑變性、糖尿病、肝臟疾病、腫瘤等。作為一種新的醫療技術，已有大量關於幹細胞治療肝臟疾病的研究報道，初步驗證了其治療的一定有效性及安全性，雖然多數研究僅限於細胞、動物水平，實現臨床轉化仍有待多重考驗，但相信隨著研究技術、內容的豐富及深入，幹細胞有望實現肝病治療的臨床轉化，為肝病尤其是終末期肝病的治療帶來新的希望。本文就相關幹細胞的分類、細胞培養移植、體內示蹤及肝病治療等的近期研究進展進行綜述。

1 治療肝病相關幹細胞

目前研究顯示，多種幹細胞在肝損傷中發揮作用，可能用於治療肝臟疾病，其中包括肝幹細胞（hepatic stem cells，HSCs）、胚胎幹細胞（embryonic stem cells，ESCs）、誘導型多能幹細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）、間充質幹細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），外周血幹細胞（peripheralblood stemcells ，PBSCs）等。

1.1 HSCs

肝幹細胞屬於成體幹細胞，存在於肝臟內，主要包括肝卵圓細胞（hepatic oval cell，HOC）和小肝細胞樣祖細胞（small hepatocyte- like progenitor cell，SHPC），其中HOC 的特點是胞體小，核大而胞質少，呈卵圓形，可雙向分化為肝細胞或膽管上皮細胞。SHPC 形態介於幹細胞和膽管細胞，通常成體HOC 先分化為SHPC 後再分化為成熟幹細胞，多數學者認為HSCs 是位於門靜脈周圍及終末膽管hering 管中，近期有國外研究發現HSCs 位於中央靜脈周圍，需要Wnt 信號來維持乾性，而中央靜脈內的血管內皮細胞負責釋放Wnt分子進入組織，如果幹細胞離開Wnt 信號的覆蓋範圍，便會迅速失去了分裂新幹細胞的能力，從而分化為成熟的肝細胞。肝幹細胞因其具有定向分化為肝細胞及膽管細胞的優勢，且不存在倫理問題，是較為理想的治療肝臟疾病的幹細胞，但目前國內外罕見有關人源性肝幹細胞系的報道。我們課題組已經從成體肝臟中成功分離出人肝幹細胞，並建立了可以穩定傳代至50 代的成體人肝源性幹細胞系HYX1，目前已初步應用於動物試驗中。

1.2 ESCs

胚胎幹細胞從受精卵內胚層中取得，屬高度未分化，是增殖能力最強的全能幹細胞，在體外相應的誘導培養條件下，ESCs 可分化為成熟肝細胞，將小鼠ESCs 移植到肝損傷小鼠模型體內，觀察小鼠肝臟內可見大量移植細胞並呈現增殖狀態。ESCs 的無限增殖能力和分化的多潛能性，在肝臟疾病中有極高的基礎與臨床研究價值，但ESCs 的倫理爭議、免疫排斥及致瘤風險等問題限制了其在臨床疾病治療中的研究及應用。

1.3 iPSCs

誘導多能幹細胞是來源於成體細胞經病毒載體重新編程而獲得的具有幹細胞特徵的細胞，具有ESCs 類似功能，但同時又避免了ESCs 的倫理爭議和免疫排斥問題，有助於解決肝細胞來源問題，一直以來是再生學領域研究的熱點，但部分學者考慮iPSCs 的重編程及高度自我更新、多向分化的特徵使其具有增加突變及致瘤風險，近期一項研究通過對比分析iPSCs 和亞克隆複製的細胞，發現iPSCs 中的大多數突變並不會在重編程或者iPSCs 產生過程中發生，認為iPSCs 是相對穩定的，可在基礎與臨床研究中安全使用。近年在經典iPSCs 重編程基礎上發展了一種新的編程技術叫做譜系重編程，即繞開了iPSCs 實現譜系內或譜系間細胞類型的轉化。王韞芳團隊通過該技術，利用小分子化合物而非轉錄因子將消化道上皮細胞重編程為誘導人內胚層祖細胞（human induced endodermal progenitor cells，hiEndoPCs），hiEndoPCs 在體外可分化為表達成熟肝細胞，並能整合到實驗小鼠肝臟中，這為肝臟疾病尤其是終末期肝病的治療研究提供了更為安全有效的新型種子細胞來源。

1.4 MSCs

間充質幹細胞是可從骨髓、脂肪組織、臍血、胎盤等組織中分離獲得的多能幹細胞，屬成體幹細胞，其中在肝病基礎與臨床中骨髓間充質幹細胞（bone marrowmesenchymal stem cells，BM- BMSCs） 和脂肪間充質幹細胞（adipose- derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）及臍血幹細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）研究較多。MSCs 在體內外特定的誘導條件可分化為多種成體成熟細胞，多項研究指出MSCs 能在生長因子、細胞因子、肝細胞或非實質肝細胞等的作用下分化為肝樣細胞，並參入肝臟疾病中免疫調節、細胞增殖及損傷修復等，MSCs 因其來源較為豐富、取材方便、易於培養、低免疫源性並不伴倫理爭議，結合目前日益發展的細胞及分子示蹤技術，有望成為肝臟疾病中幹細胞研究的理想種子細胞來源。

1.5 PBSCs

外周血幹細胞是外周血中唯一CD34 陽性的細胞，在正常情況下數目非常少，經集落刺激因子動員後迅速增多，收集後可用於疾病的治療，其在血液系統疾病治療中的應用較為成熟，近年發現也可用於肝損傷的治療，但目前肝病中應用PBSCs 治療的研究主要集中在其對癥狀、預後改善上，其中的具體機制及其治療的穩定性等研究甚少，PBSCs 是否是理想的細胞來源有待進一步驗證。

2 幹細胞培養移植方法

在幹細胞治療肝病相關研究中，不同培養狀態的幹細胞可通過不同途徑的移植到達實驗動物模型或人體體內，從而發揮相應的作用。目前體外幹細胞主要在二維培養條件下進行增殖和分化，雖具有易操作、低費用等優點，但細胞在形態、結構和功能方面都與在體內生長狀態有顯著差異，通常會導致體內實驗不能重複體外實驗結果，為儘可能模擬體內細胞的生長狀態，使細胞能夠在立體空間培養增殖，近年來三維培養技術在幹細胞培養中受到廣泛研究及關注，包括需要支架的和不需要支架的三維培養技術，目前常見的三維細胞支架有膠原、水凝膠、聚合物纖維支架等，隨著3D 生物列印及相關技術發展，三維支架種類層出不窮，為幹細胞研究提供了更為有效的培養體系。非支架三維培養技術主要是通過物理方法使細胞處於懸浮狀態，主要有微載體、懸滴板、磁懸浮等技術。近期國外有研究利用微流控技術，以水/ 水/ 油雙乳化作為模板培養肝細胞及成纖維細胞，從而在「小水滴」中構建出微型3D 肝模型，此培養模式在幹細胞中可能也有一定的借鑒價值。將培養的幹細胞移植入動物或人體體內，分別主要通過以下途徑：經外周靜脈（如鼠尾靜脈、眼底靜脈叢）、門靜脈、肝動脈注射輸入，以及向腹腔內、肝臟內、脾臟內直接注入等。

此外還有一些較為新穎的培養移植方式，日本近期一項研究將人誘導多能幹細胞衍生肝細胞樣細胞（humaninducedpluripotentstem cell derived hepatocyte- like cells ， iPSHLCs）培養在生物材料上形成細胞片，隨後將細胞片附著於肝衰竭小鼠的肝表面來發揮抗肝損害作用，同時與脾內移植途徑相比，提示該方法減少了肝臟以外器官的意外移植風險。有研究在體外通過共同培養人源性iPSC、間質祖細胞及內皮祖細胞，誘導形成了肝芽樣結構（微型肝），進而異位移植於免疫缺陷小鼠腹腔內來發揮一定肝臟代謝作用。更有將幹細胞植入脫細胞化的肝臟中，利用其基質骨架、血管網結構，有助於支持肝幹細胞的分化成熟和成熟細胞的存活。總結上述研究發現不同培養方式，不同時期、不同次數及不同途徑移植，產生效果都會有所不同，且各有優劣，選擇適宜的培養移植方案及研究更好的方案，最大限度使幹細胞發揮原有甚至更好的功能，也是目前幹細胞研究任務之一。

3 移植幹細胞示蹤

為了更好的了解幹細胞植入、分布、存活、遷移、分化及功能等情況，幹細胞示蹤技術[17]在此尤為重要，常見有熒光染料標記、核酸標記、報告基因轉染標記等，均屬於病理示蹤，難以在活體狀態下分析，而光學成像、核素顯像、磁共振成像等技術可實現活體體外示蹤。以下為其中三種較為常見的示蹤方法：1. 細胞膜熒光染料標記，如紅色熒光染料PKH26，能與細胞膜的脂質區穩定結合，且對所標記細胞的生物活性和增殖能力沒有影響，能高效追蹤移植的細胞，但熒光染料會隨著幹細胞增生分化而稀釋淬滅，故僅適用於短期細胞追蹤研究；2.慢病毒綠色熒光蛋白轉染，通過慢病毒載體介導的基因修飾使幹細胞高效穩定表達綠色熒光蛋白，能較好的對移植幹細胞進行示蹤，但轉染後對細胞的生物學特徵可能有所影響，具體應用時有待對比監測；3. 超順磁氧化鐵納米顆粒標記移植細胞的磁共振成像技術，是較為新穎的技術，通過細胞標記與體外核磁共振成像聯合，可更加有效的實現對移植幹細胞的無創性活體示蹤。此外還可以根據研究需要將多種示蹤途徑進行聯合，實現了更加精確的病理及活體示蹤監測。

4 幹細胞與肝臟疾病治療

4.1 肝功能衰竭

肝衰竭是由多種原因引發的肝功能嚴重障礙或失代償臨床症候群，病死率極高，目前內科及人工肝治療只能姑息對症，肝移植是最終唯一有效的辦法，但肝移植受肝源、費用限制，迫切需要尋找新的有效治療方法。幹細胞因其自我更新和分化潛能為肝衰竭的治療提供了新的方向，近年來有較多相關研究報道。義大利研究者首次報道利用人源性肝幹細胞治療LPS/D- 半乳糖誘導的暴發性肝衰竭小鼠模型，人肝幹細胞可緩解模型小鼠肝細胞凋亡、促進肝細胞增殖，從而起保護作用。我們課題組通過腹腔移植成體人肝源性幹細胞能顯著減輕刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）誘導的小鼠急性肝損傷，並揭示了移植治療的最佳時機及作用時間。日本一項研究將體外培養的人源性iPS- HLCs細胞片附著在四氯化碳誘導的急性肝衰竭小鼠肝臟表面，通過該細胞片分泌肝細胞生長因子的機制發揮保護作用。國內一項研究利用人BM-MSCs 肝內移植成功救治暴發性肝衰竭大型動物（豬）模型，其間通過大規模抗體晶元、全基因測序、蛋白質譜分析等新技術，闡述移植人BM-MSCs 與宿主間相互作用規律，結果發現植入幹細胞可明顯抑制暴發性肝衰竭中致命性細胞因子風暴，通過旁分泌抑制機體炎症介質分泌、調節免疫反應等，緩解肝臟損傷，最終促進肝臟再生修復，並揭示DLL4（delta- like ligand 4）分子在幹細胞移植對肝組織修復中發揮了重要作用。在慢加急性肝衰竭（acute- on- chronic liver failure，ACLF） 中幹細胞治療研究相對偏少，2012 年一項研究評估了乙型肝炎病毒相關的ACLF 患者的UC-MSCs 治療的安全性和初始療效，共納入43 名ACLF 患者，24 例患者接受UC-MSCs 治療，19 例患者接受鹽水對照治療，以4 周間隔給予UC-MSCs 治療3 次，在48 周或72 周評估發現UC-MSCs 可改善ACLF 患者病情，顯著增加生存率，並驗證其治療具有一定的安全性。有研究通過體外共培養人源性iPSC、間質祖細胞及內皮祖細胞，誘導分化成肝芽樣結構（微型肝），再通過異位移植途徑植入於免疫缺陷小鼠腹腔內，血管生成後可刺激肝細胞成熟，能顯著改善化學藥物誘導的肝衰竭小鼠的預後，考慮該肝芽可作為肝外來源的肝臟支持系統提供潛在的治療作用。總結上述研究，幹細胞移植治療肝衰竭主要機制在於免疫調節或產生相關細胞因子及生長因子抑制炎症、促進殘存肝細胞增殖、組織修復等，有效性及安全性初步明確，但目前尚缺乏大規模、長期隨訪的臨床試驗研究。

4.2 肝硬化

我國肝硬化發病率逐年增高，失代償期患者內科治療效果欠佳，病情易反覆並逐漸加重，生活質量極差，近年幹細胞移植治療肝硬化也初見成效。一項多中心、隨機研究中通過自體BM-MSCs動脈輸入移植治療72 例酒精性肝硬化患者，觀察可在組織學水平改善肝臟纖維化，改善肝功能水平，並證實具有安全性。國內一項回顧性研究觀察人UC-MSCs 治療失代償性乙型肝炎肝硬化的安全性與療效，入組乙型肝炎肝硬化失代償期患者60 例，對照組120人，發現經UC-MSCs 治療後可改善治療組患者膽鹼酯酶及白細胞水平，降低Child- Pugh 評分，且具有安全性，分析可能機製為UC-MSCs 移植後能夠歸巢並定植到病損的肝組織，刺激肝細胞增殖，修復受損的肝組織，抑制肝纖維化，但其中具體分子機制尚不明確。有關幹細胞治療肝硬化患者的效果、遠期安全性有待進一步探討及驗證。

4.3 肝癌

幹細胞在肝癌治療中的研究目前較少，日本一項研究指出，干擾素β（interferon-β，IFN-β）具有抗癌作用，但因體外易快速失活，組織穿透性差，導致該藥物不能得到廣泛使用，可用人源性誘導多能幹細胞來源的骨髓細胞（iPS cell- derived myeloid lineage cells， iPS-ML） 來表達IFN-β，經腹腔注射iPS-ML 給肝癌小鼠模型後，可緩解小鼠腫瘤的進展，延長存活時間。提示iPS-ML 可作為藥物運輸系統，可能會對肝癌病人有治療價值。這項研究為肝癌的治療提供了新的思路，對肝癌治療研究有很好的啟發性。

4.4 非酒精性脂肪性肝病（non- alcoholic fatty liver disease，NAFLD）

目前該病在全世界發病率逐年增加，是一種被嚴重低估的慢性肝損傷疾病，疾病最初可僅表現為脂滴累積，但隨著疾病進展，會逐漸發展為非酒精性脂肪肝炎，甚至發展至肝硬化、肝癌。干預治療除飲食控制、運動，降血脂等之外，目前尚無效果明確的針對性藥物，近期有兩項體內實驗研究顯示幹細胞移植有助於改善非酒精性脂肪肝，將大鼠脂肪組織分離的AD-MSCs 通過門靜脈移植給高脂肪飲食誘導的NAFLD 大鼠，與對照組相比，模型大鼠肝臟組織病理提示肝損傷緩解、脂質累積減少，血清促炎因子，腫瘤壞死因子-α和白細胞介素- 6 水平下調，即通過改善肝功能、促進脂質代謝、減輕氧化應激來幫助NAFLD 的逆轉，從而發揮肝保護作用。據此幹細胞移植可能是NAFLD新的潛在治療策略。

4.5 自身免疫性肝病

該病在我國患病率逐年增加，臨床中治療手段有限，且一定數量的患者對內科針對性的治療反應欠佳，尋找新的治療方法一直是自身免疫性肝病研究的方向之一。有研究發現對熊去氧膽酸治療應答不佳的原發性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）患者予UC-MSCs移植治療，可緩解患者的乏力及瘙癢症。10 例對熊去氧膽酸治療應答不佳的PBC 患者接受異基因骨髓MSCs 治療後，外周淋巴細胞中CD8+T 細胞數量減少，同時CD4+CD25+Foxp3+T細胞增多，肝功能指標改善，且治療過程安全。另有研究發現間充質幹細胞可通過激活程序性死亡- 1（programmeddeath 1，PD- 1）通路，發揮免疫抑制作用，改善自身免疫性肝炎小鼠的肝損傷。這些研究均提示幹細胞移植可改善免疫反應從而改善自身免疫性肝病肝損傷。

5 總結

幹細胞移植作為肝臟疾病新的治療手段受到廣泛的關注，目前已初步驗證其具有一定的有效性及安全性，但有關遠期療效及安全性、相關幹細胞發育分化調控機制、在肝臟疾病治療的臨床轉化及作用的具體機制尚不明確，仍有非常多的難題亟待解決，但相信隨著幹細胞相關領域如幹細胞分離、基因重組、培養、移植、示蹤、構建生物人工肝、組織工程化肝臟等研究的不斷突破，幹細胞移植這一技術終會真正應用於臨床肝臟疾病的治療。正如iPSC創始人、諾貝爾獎獲得者山中伸彌今年在《紐約時報》專訪中所說「幹細胞距離臨床應用依然需要時間和金錢」。

作者簡介：李珊珊，女，28 歲，博士研究生，主治醫師。主要從事肝衰竭的基礎與臨床研究

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