Nat Biotech丨上科大、中科院聯合開發新型鹼基編輯器

本文轉載自「BioArt」。

自2016年David Liu實驗室、日本神戶大學Akihiko Kondo實驗室以及我國科學家常興實驗室先後在Nature、Science和Nature Methods雜誌上發表了基於Cas9的單鹼基基因編輯系統之後，相關研究迅猛發展、方興未艾。由於單鹼基編輯系統可能極大地推動疾病模型製備、動植物的育種和人類疾病的臨床治療，因此目前迫切需求該系統變得越來越精確高效。目前已報道的鹼基編輯系統均是基於Cas9蛋白，然而基於Cpf1（Cas12a）的新型鹼基編輯器暫未見報道。那麼基於Cpf1（Cas12a）的單鹼基編輯系統有什麼優勢呢？

近日，上海科技大學生命學院陳佳教授研究組、中國科學院－馬普計算生物學研究所研究員楊力研究組與上海科技大學生命學院黃行許教授研究組通過合作研究，開發出一系列基於CRISPR/Cpf1（Cas12a）的新型鹼基編輯器（Cpf1-BE），相關成果以Base editing with a Cpf1– cytidine deaminase fusion為題，在Nature Biotechnology 上在線發表。

傳統的CRISPR/Cas9基因編輯技術雖然具有較高的基因敲除效率，但在執行鹼基替換（譬如對造成遺傳性疾病的點突變進行矯正）時效率通常很低，這也限制了CRISPR/Cas9基因編輯的應用。近年，利用將CRISPR/Cas9和APOBEC（胞嘧啶脫氨酶）整合而發展出的新型鹼基編輯系統（Base Editor, BE），可在單鹼基水平（如胞嘧啶向胸腺嘧啶）實現高效率的基因組靶向編輯改造【1-7】。這種新型鹼基編輯系統理論上可對數百種引起人類疾病的基因組點突變進行定點矯正，因此擁有巨大的臨床應用潛力。

目前已報道的鹼基編輯系統均是利用Cas9蛋白（主要是Streptococcus pyogenes Cas9, SpCas9和Staphylococcus aureus Cas9, SaCas9）執行與基因組的靶向性結合，而這種靶向性結合依賴於靶點旁側的PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列。SpCas9和SaCas9蛋白所識別的PAM序列多含鳥嘌呤/胞嘧啶（G/C-rich），因此利用已報導的鹼基編輯系統無法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集（A/T-rich）區域進行高效的鹼基編輯操作。

在這項最新的研究中，來自上海科技大學和中科院的科研人員通力合作，構建了一系列基於CRISPR/Cpf1蛋白的新型鹼基編輯器（Cpf1-BE）。由於Cpf1 蛋白可識別富含腺嘌呤/胸腺嘧啶的PAM序列【8-12】，這種基於Cpf1的新型鹼基編輯器實現了在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集區域的鹼基編輯操作。在拓展編輯區域的同時，基於Cpf1的新型鹼基編輯器所產生的編輯副產物也較低，因此具有更高的編輯精準度。這種基於Cpf1的新型鹼基編輯器與現有的基於Cas9的鹼基編輯器可實現鹼基編輯的有效互補，為鹼基編輯系統在基礎研究及未來臨床領域的全面深入應用提供了新方法、拓展了新思路。

Cas9鹼基編輯器與Cpf1鹼基編輯器的特點比較

據悉，該工作在陳佳教授、楊力研究員、黃行許教授的共同指導下，由陳佳研究組2014級碩博連讀研究生李瀟颯、楊力研究組2015級碩博連讀研究生王瀅和黃行許研究組2014級碩博連讀研究生劉亞京等共同完成。

值得一提的是，陳佳課題組和楊力課題組及其合作者在最近一年時間中先後還在Cell Research和Nature Structure Molecular Boilogy雜誌上發表研究論文，開發了一種增強型鹼基編輯器（enhanced base editor, eBE），其克服了原有鹼基編輯技術保真度較低的缺陷，實現了更高準確度的基因組單鹼基編輯【6】；研究揭示了胞嘧啶脫氨酶(APOBEC)在CRISPR/Cas9引發的DNA斷裂修復過程中產生突變的新機制，提出了利用雙鏈寡聚核苷酸或者雙鏈質粒DNA作為修復模版、以及抑制內源APOBEC的策略來提高CRISPR/Cas9編輯的保真度和精確性，為進一步提高基因組編輯保真度提供了新思路【13】。

參考資料

1. Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA and Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016, 533:420-424

2. Nishida K, Arazoe T, Yachie N, Banno S, Kakimoto M, Tabata M, Mochizuki M, Miyabe A, Araki M, Hara KY, Shimatani Z and Kondo A. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science, 2016, 353:

3. Kim K, Ryu SM, Kim ST, Baek G, Kim D, Lim K, Chung E, Kim S and Kim JS. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nat Biotechnol, 2017

4. Zong Y, Wang Y, Li C, Zhang R, Chen K, Ran Y, Qiu JL, Wang D and Gao C. Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9- cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2017

5. Lu Y and Zhu JK. Precise Editing of a Target Base in the Rice Genome Using a Modified CRISPR/Cas9 System. Mol Plant, 2017, 10:523-525

6. Wang L, Xue W, Yan L, Li X, Wei J, Chen M, Wu J, Yang B, Yang L and Chen J. Enhanced base editing by co-expression of free uracil DNA glycosylase inhibitor. Cell Res, 2017, 27:1289-1292

7. Hu JH, Miller SM, Geurts MH, Tang W, Chen L, Sun N, Zeina CM, Gao X, Rees HA, Lin Z and Liu DR. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature, 2018

8. Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV and Zhang F. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 2015, 163:759-771

9. Yamano T, Nishimasu H, Zetsche B, Hirano H, Slaymaker IM, Li Y, Fedorova I, Nakane T, Makarova KS, Koonin EV, Ishitani R, Zhang F and Nureki O. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell, 2016, 165:949-962

10. Dong D, Ren K, Qiu X, Zheng J, Guo M, Guan X, Liu H, Li N, Zhang B, Yang D, Ma C, Wang S, Wu D, Ma Y, Fan S, Wang J, Gao N and Huang Z. The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA. Nature, 2016, 532:522-526

11. Stella S, Alcon P and Montoya G. Structure of the Cpf1 endonuclease R-loop complex after target DNA cleavage. Nature, 2017, 546:559-563

12. Swarts DC, van der Oost J and Jinek M. Structural Basis for Guide RNA Processing and Seed-Dependent DNA Targeting by CRISPR-Cas12a. Mol Cell, 2017, 66:221-233 e224

13. Lei, L., Chen, H., Xue, W., Yang, B., Hu, B., Wei, J., ... & Yan, L. (2018). APOBEC3 induces mutations during repair of CRISPR–Cas9-generated DNA breaks. Nature structural & molecular biology, 25(1), 45.

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