磷酸化組學揭示T細胞激活後的信號通路和代謝途徑的動態變化
景傑編者按：
蛋白質的磷酸化修飾是目前為止研究最為深入也最為廣泛的一種翻譯後修飾形式之一，它在多種生物學事件中發揮關鍵作用。今天給大家介紹的這篇文章來自於美國St. Jude兒童研究醫院遲洪波教授、彭軍明教授合作的成果，利用磷酸化組學技術研究T細胞激活後的信號和代謝通路[1]。
文章通過蛋白質組學和磷酸化組學發現了導致T細胞靜息狀態改變的信號網路和代謝途徑，闡明了TCR可以激活相互關聯的一些功能模塊，如激酶和轉錄因子，這些模塊在T細胞激活過程中都發揮了關鍵的調控作用；另外，藉助組學分析還發現，複合物mTORC1和TCR的相互作用對線粒體的核糖體生物合成和複合物IV的生物活性都具有很重要的調控作用，而後者們在T細胞激活後的代謝調控中起著關鍵作用；文章進一步還發現線粒體酶COX10介導的氧化磷酸化無論是在體內還是體外都對T細胞的激活至關重要。
實際上，關於磷酸化修飾的研究非常的廣泛，迄今為止，已有很多文章報道了它在各個研究領域的應用。
磷酸化修飾廣泛參與細胞內信號通路的調控。2013年，朱健康院士課題組在PNAS上報道，通過磷酸化修飾組學技術比較了野生型和snrk2.2/2.3/2.6突變型的擬南芥種子磷酸化修飾蛋白的差異，再結合體外激酶實驗篩選出蛋白激酶SnRK2s下游的作用底物，發現這些底物蛋白參與開花時間調控，miRNA和表觀遺傳調控，信號轉導等進程[2]。
磷酸化修飾還參與生物發育過程的調控。2016年，景傑生物與韓國科學家合作，通過磷酸化修飾組學技術研究了斑馬魚胚胎髮育過程中蛋白質磷酸化水平的變化，根據受精後不同時期中蛋白質磷酸化的持續變化，將480個不同通路中的磷酸化蛋白歸成6大類，為今後斑馬魚胚胎的磷酸化研究提供了參考[3]。
磷酸化修飾還與病原體侵染過程相關。2017年國際著名期刊Cell Host & Microbe研究報道，通過磷酸化修飾組學技術分析了新型隱球菌（Cn）侵染宿主初期激酶網路的變化情況，發現mTOR、STK11/LBK1和 AMPK/AIC信號通路的劇烈變化。通過體內體外模型的功能實驗證明，AMPK/AIC信號通路是Cn侵染宿主、病菌複製和引發病理變化的驅動因素，不僅為研究真菌與宿主互作機制提供了重要的數據資源，更為相關疾病的治療尋找到了潛在的藥物靶點[4]。
磷酸化修飾在生物節律調控過程中也發揮關鍵作用。2016年，國際知名期刊Cell Metabolism上的研究報道，通過磷酸化修飾組學技術分析小鼠肝臟組織核蛋白表達譜及磷酸化修飾譜，證實一系列核蛋白複合體的蛋白表達水平或磷酸化修飾水平受到晝夜節律動態調控，這些複合體參與了轉錄調節、DNA損傷修復、核糖體的生物合成、細胞周期、染色體多倍性等多種生物學過程[5]。
磷酸化修飾在細胞周期中也發揮作用。2016年，Cell發表研究性文章指出，基於磷酸化修飾組學分析檢測裂殖酵母CDK底物的磷酸化水平，發現在細胞周期中不同CDK底物的磷酸化與細胞處於何種細胞分裂階段有著密切關聯。細胞分裂受到細胞周期蛋白-CDK活性閾值及底物特異性的共同的精細調控[6]。
磷酸化修飾在藥物作用過程中發揮作用。去年，德國慕尼黑理工大學的研究者在國際著名期刊Cancer Research上發表論文，採用蛋白質組學和磷酸化修飾組學綜合分析了拉帕替尼敏感和耐葯細胞系中的蛋白質和磷酸化變化，發現AKT信號通路和糖酵解過程在耐葯細胞系中發生顯著改變，並可以作為針對性的治療靶標[7]。
磷酸化修飾參與細胞分化調控。2017年，EMBO Journal上一篇文章表明，通過對錶皮祖細胞分化前後的磷酸化修飾水平進行定量比較，發現磷酸化修飾水平變化最顯著的是與細胞黏著相關的橋粒蛋白（desmosome proteins），其中橋粒蛋白PKP1的磷酸化水平又受激酶RIPK4的調控，且在細胞分化後顯著上調。更為重要的是，細胞和動物模型實驗表明，Pkp1或Ripk4的缺失都會破壞表皮正常分化，誘發表皮癌變[8]。
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關鍵詞：
磷酸化 信號通路 免疫
研究思路與結果：
在適應性免疫過程中，位於胸腺中的T細胞存在兩種狀態，一種是靜息狀態，一種是激活狀態，兩種狀態之間的轉變受到複雜而精細的調控作用。抗原的刺激是比較常見的一種調控。在抗原刺激時，T細胞表面的T細胞受體TCR可觸發一系列信號級聯反應，最終導致白細胞介素2（IL-2）和細胞表面受體的積累，促進細胞生長和增殖，並最終分化成效應細胞。然而，關於這個過程中發生了哪些具體的信號變化和通路變化至今還未得到闡明。有研究表面，線粒體的氧化磷酸化可促進T細胞激活，而T細胞激活後又會上調線粒體的氧化磷酸化，進而影響線粒體的功能，進一步導致T細胞的增殖受到影響。然而，其具體的過程和信號網路還不得而知。
為了深入研究這一變化過程中的具體機制，這篇文章對不同刺激階段的T細胞進行了多組學分析。由於轉錄水平往往很難預測實際蛋白水平的變化，尤其是線粒體氧化磷酸化過程引起的蛋白磷酸化水平的變化更是難以檢測，因此作者採用了蛋白組學和磷酸化組學結合的方式進行了研究。
首先，作者通過構建TCR刺激的小鼠模型，選擇未刺激和TCR刺激2h、8h和16h的T細胞作為實驗樣本，同步進行基於高通量的蛋白組學和磷酸化修飾組學研究，分別鑒定到8431個蛋白和13755個磷酸化肽段（圖1A）。為了驗證組學結果，作者採用western-blot的方法分別檢測了TXNIP和PDCD4的表達量，以及PDHA-1和CAD的磷酸化變化情況，發現其與組學結果保持高度一致（圖1B和C）。
圖1. 實驗設計及驗證
此外，為了排除取樣時不同樣本和樣本本身變化的影響，作者還進行了統一處理不同樣本和同一樣本不同處理的數據關聯分析，發現其帶來的誤差都是隨機性分布的，從而排除了取樣和樣本自身對實驗結果產生影響的可能性。值得一提的是，由這些分析可以看出，磷酸化的變化情況相對蛋白質來說是比較大的，這可能是由於磷酸化在體內的快速變化導致的。進一步的主成分分析和聚類分析都證明了該結果的可靠性。
在初始T細胞激活過程中，翻譯水平上的調控比轉錄水平上的調控對胞內蛋白變化影響更大。本文作者也做過T細胞刺激8h後的蛋白與mRNA水平上的分析，發現兩者的相關性很差，當以1.5倍作為差異時，僅有很小的一部分保持一致。這些結果都說明在TCR刺激後的T細胞激活過程中，存在獨特的分子調控網路來調節胞內蛋白的變化。為了進一步研究其蛋白動態變化的模式，作者又對鑒定到的8431個蛋白進行了ANOVA的差異表達分析，共找到1712個差異表達蛋白，再將行使相似生物學功能和調控機制的高度相關的差異表達蛋白依據共表達聚類WGCNA分析，分為6個大類，分別是WPC1-6，分析得到了每一類中與T細胞激活密切相關的調控通路，功能注釋分析顯示IL-2和TNFa信號通路在其中起著關鍵的作用（圖2）。
圖2. 蛋白組數據聚類分析和功能注釋分析
接著，作者又對上述6大類進行了蛋白互作網路分析，將其分為90個功能模塊，這裡的模塊是指系統級的功能單元，可以相互交互以形成模塊級的網路。每個模塊含有的蛋白數基本都在2-56個之間，其中80個模塊是由WPC3類中的蛋白組成，最大的一個模塊主要包含WPC3中的核糖體蛋白，這表明了T細胞活化時其功能調控的一致性。由此數據也可以看出，通過組學的分析手段是發現很多未知功能模塊的一個有效方法，例如關於蛋白酶體意外激活的43號模塊就是這樣發現的。進一步的分析還發現了TCR刺激導致的6個線粒體信號通路的變化。
採用同樣的方法，作者還分析了磷酸化修飾組學獲得的數據，找到3280個差異磷酸化肽段，7個共表達聚類PPC1-7，34個激活的激酶，並利用時間數據和IKAP推斷的激酶活性，重構了激酶信號網路（圖3），這些數據都表明，TCR刺激T細胞後，AKT-mTOR和GSK3分別作為T細胞激活的正、負調節劑在磷酸化蛋白質組的動態重構中發揮著關鍵調控作用。
圖3. 磷酸化組學的聚類分析和構建的激酶網路
為了準確地預測T細胞激活過程中的轉錄因子及激酶活性變化情況，作者將蛋白組和轉錄組數據進行整合分析，發現了56個與激活相關的轉錄因子，通過蛋白組和磷酸化組學的數據驗證得到了30個激活轉錄因子，再依據公共資料庫中已知的轉錄因子和激酶關係網路篩選得到19個激酶。最終構建了T細胞激活過程中含30個激酶和19個轉錄因子的網路（圖4）。通過複雜的分析，文章確定了與T細胞激活過程中轉錄、翻譯和翻譯後修飾調控相關的轉錄因子和激酶。
圖4. 蛋白組、轉錄組和磷酸化組學數據的整合分析
經上述組學分析發現，mTOR信號通路在TCR刺激T細胞活化過程中發揮關鍵作用，為了進一步研究其如何發揮作用，作者突變了其中的關鍵因子Raptor，然後選擇突變前後的細胞進行與上述一樣的蛋白質組和磷酸化組學分析，共鑒定到9178個蛋白和10159個磷酸化多肽，結合一系列相似的生物信息學分析，最終發現mTORC1在該過程中是一個關鍵的負調控因子，可以在TCR刺激T細胞後在轉錄、翻譯和翻譯後修飾水平上通過激活線粒體的功能代謝來調控相關的免疫和代謝通路。
為了進一步研究涉及到T細胞激活的具體的線粒體途徑和上游信號，作者結合免疫熒光、流式細胞及一些生化指標的測定，分別確認了線粒體上的核糖體、COX10（一種有利於複合物IV表達和組裝的輔助因子，在T細胞激活中發生上調）、HK2（糖酵解過程中的關鍵限速酶）三種分子在T細胞激活過程中的關鍵作用，發現TCR刺激T細胞後，COX10是初始T細胞進入細胞周期，增殖並長期存活的關鍵。進一步通過敲掉COX10的小鼠，發現COX10是TCR刺激T細胞後，T細胞增殖分化形成Th1細胞並參與抗細菌免疫反應的關鍵。
結論：
本文通過對TCR刺激後的T細胞進行蛋白組學和磷酸化組學分析，結合公共資料庫中的轉錄組數據分析，從多組學的層面上對T細胞激活後的分子調控網路進行研究，找到了多個關鍵的功能模塊、激酶和調控蛋白，結合一些生化分析實驗最終驗證了複合物mTORC1和TCR通過彼此之間的相互作用對線粒體的核糖體生物合成和複合物IV的生物活性進行調控，進一步調控T細胞激活後的代謝過程；敲除實驗和生化分析還證實線粒體酶COX10介導的氧化磷酸化無論是在體內還是體外都對T細胞的激活至關重要。整個文章從總體層面對T細胞激活後的蛋白變化情況和磷酸化的動態變化進行了分析，為後續研究提供了很好地方向，也為進行類似研究提供了一個很好的借鑒。
參考文獻：
1. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Pro?ling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation.Immunity(2017).
2. Quantitative Phosphoproteomics Identifies SnRK2 Protein Kinase Substrates and Reveals the Effectors of Abscisic Acid Action.PNAS, 2013.
3. Global Analysis of Phosphoproteome Dynamics in Embryonic Development of Zebrafish (Danio rerio).Proteomics, 2016.
4. Global Reprogramming of Host Kinase Signaling in Response to Fungal Infection.Cell Host & Microbe, 2017.
5. Nuclear Proteomics Uncovers Diurnal Regulatory Landscapes in Mouse Liver.Cell Metabolism, 2016.
6. CDK Substrate Phosphorylation and Ordering the Cell Cycle.Cell, 2016.
7. Lapatinib Resistance in Breast Cancer Cells Is Accompanied by Phosphorylation-Mediated Reprogramming of Glycolysis.Cancer Research, 2017.
8. Phosphorylation of Pkp1 by RIPK4 Regulates Epidermal Differentiation and Skin Tumorigenesis.EMBO Journal, 2017.
景傑生物通過整合以組學為導向（包括基因蛋白質組學和組蛋白密碼組學）的生物標誌物發現、以生物標誌物為導向的藥物研發、以高質量抗體為基礎的診斷試劑盒開發這三個環節，逐步構建起「疾病精準分層」、「精準藥物研發」、「疾病精準診斷」 三位一體的精準醫療產業化發展的運作鏈條，從而為精準醫療產業化開創出一片廣闊前景, 並開闢出一條可行路徑。
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