16S＋功能預測也能發Sciences：屍體降解過程中的微生物組

Metcalf, J. L., et al. (2016). 「Microbial community assembly and metabolic function during mammalian corpse decomposition.」 Science 351(6269): 158-162.

2015年12月10日在線發表，截止至18年3月21日Google統計引用88次。

本文是Rob Knight (https://knightlab.ucsd.edu/)通訊發表的頂級文章之一，他有多牛呢？他是全球知名的HMP項目總負責人，僅2017發表高水平文章41篇，截止3月21日，累計發表文章532篇，引用116,384次，代表作QIIME引用10,172次。

下面開始聊文章

文章簡介

標題：哺乳動物屍體降解過程中微生物群落組成與代謝功能

摘要：在陸生生活的脊椎動物屍體降解是營養循環中重要的階段，然而微生物介導的過程仍知之甚少。我們採用擴增子、功能預測和環境因素分析來揭示不同土壤類型下人類和小鼠的屍體分解過程。我們發現了一套細菌和真菌組，它們形成可重複的分解者網路和氮循環，並且可預測出現時間。結果表明分解者主要來自於土壤，但通常只有較低的丰度，分解過程的可重複為法醫學研究提供了新的研究手段。

科學問題

降解微生物群落的來源是什麼？

降解微生物群落的動態變化特徵？

不同宿主/個體降解微生物群落的共性和個性？

材料方法

小鼠屍體：選取120個雌性小鼠屍體分別置於草原、森林和沙漠不同環境土壤上，在不同時間節點搜集小鼠屍體下的土壤，同時採集未受土壤污染的小鼠頭部和身體皮膚樣品、腹部腸道樣品

人類遺體：4具捐贈遺體樣本，不同環境不同季節下自然放置，採集不同時間和部位的皮膚樣品和土壤樣品

環境因子收集：地上植被和地下土壤pH、C、N含量等

16S，18S，ITS採用HiSeq，MiSeq測序

主要結果解讀

為了方便大家閱讀，我們盡量將組圖拆並解讀，手機閱讀體驗更好。

不同環境下分解者微生物組相似

圖1. 微生物分解者群體在不同環境下相似。

(A) 基於unweighted unifrac距離的主坐標軸分析小鼠皮膚細菌和古菌群體，顏色按時間和土壤類型著色。可以看出菌群結構隨時間變顯。但不同土壤類型在屍體分解菌群前3軸沒有明顯區別。

PCoA圖展示時間序列變化和土壤類型無差異；其實第一個發現比較common sense，而第二個更shocking，沙漠、草地、森林三種常見的土壤類型，本質上有很大差異，但居然對屍體分解過程影響不大，這個發現更重要，為可重複的法醫學提供了更有效的分析方法。這種三維散點圖有很多種做法，R中的scatterplot3D可以繪製，本公眾號講過的recharts2和canvas均可以繪製。

(B) 熱圖展示人類屍體皮膚的菌相對丰度，數值採用對數轉換的千分數，按時間點出現峰值順序排列。這個展示方式是很有講究的，行按時間排序，列按物種在每個時間出現最大值的時間排序，多組時要取均值再排序，再按各組按順序排列，才有好的效果。

(C) 對冬季皮膚的菌群採用隨機森林模型訓練，並使用春天數據驗證。紅色為真實數據預測值與真實值分布，灰色為隨機猜測的值(對照)。我們看到模型的相關性達到0.77，但紅色預測值 大多數偏高，因為春天溫度比冬天高，微生物繁殖快，如果使用春天數據建模，相關性會更準確。將來的分析將結合溫度、晝夜溫差等因素來建模；氣象數據容易獲得，最起碼有平均溫度來預測，會進一步提高準確性。

(D) 顏色的線代表三種模型中Top100特徵(feature/biomarker)在人鼠、冬夏中共有的數量。而灰色為隨機特徵的共有數量。

我們可以看到人鼠間共有的特徵細菌種類較少，但真菌較多；人不同季節間細菌、真菌共有比例較高。即分解存在物種差異性，遠大於季節差異性。

個人理解人與小鼠的皮膚有、無毛，是差異極大的棲息環境，會影響菌群的差異，和分解者的定殖。

分解者的來源

圖2. 細菌、古菌分解者來自多個環境，但主要來自土壤。

(A) 動態貝葉斯推理網路: 分解過程微生物分類群神經信息流動網路，土壤是其主要來源。小鼠四種取樣位置分分別為頭、軀幹、腹部和土壤。顏色為3種環境，分別為沙漠、草地和森林，且均與土壤來源微生物非常顯著相關。

這種分析這適合自然樣品，在現代社會，很多死亡在屋內、床上等人為環境，這方面也非常值得研究，前提得拿到捐獻者、合適環境等。

(B) 所有樣品第1天中分解者的丰度。表明其為低丰度菌。

初始分解者的鑒定，更有利於跟蹤分解過程中微生物來源等重要的線索。在實際應用中有助於發現真實案發現場。

腹腔內分解者群落功能變化

圖3. 腹腔內分解者群落的演替

(A) 分解過程動態貝葉絲網路展示古菌、細菌、真核微生物、環境因子關係。箭頭顯示因果關係方向，層級排列網路代理演替(proxy for succession)。

(B) 盲腸組成Picrust預測KO進行PCoA分析；基因功能隨時間變化不明顯。(C) 代謝物功能與時間區別較明顯。利用變與不並，展示出發現核心因素的過程——如何找到關鍵點。

(D) Picrust預測功能基因的與屍解特異的基因類型(亞硝酸還原酶——亞硝酸鹽轉換為氨鹽、賴氨酸脫羧酶——形成屍胺；1，5-戊二胺、鳥氨酸脫羧酶——腐胺)變化。

關於高水平文章使用PICRUSt預測，在人類上還是可行的，畢竟積累多，準確度高。關於基因功能類型的選擇，需要有專業背景知識，本文中選擇的代謝通路，即使是外行也聽說過，這才是CNS文章想要的效果——説人話，講科普。最後説下散點圖的的擬合，有多種方法，而且可以配合公式使用，變化無窮，可以調整多種樣式，科學地挖掘數據表達發現的規則。

環境因子分析

圖4. 土壤理化性質在哺乳動物分解中的效應

(A) pH、氨、氮的變化在小鼠死亡土和自然土，誤差棒為1倍標準差；

更是展示如何從死亡土中挖掘與死亡時間的關聯。

(B) CCA分析預測的代謝功能，並結合主要環境因子的關係；

首先看到樣本點在時間序列上的梯度變化，其實是環境因子與主軸間的關係、貢獻大小和相關程度。

(C) 死亡土中谷氨酸降解酸酶和亞硝酸還原代謝相關基因隨時間變化。

使用死亡土的微生物群落功能變化來研究與死亡時間的關係。

此處的研究為法醫學提供了很大幫助，即使屍體被移走，也可以採用土壤的鑒定來判斷第一現場，作案時間等信息。

小結

研究結論

降解微生物群落（細菌和真菌）隨時間展現出固定的變化模式

屍體下面的土壤是降解微生物的主要來源，但是土壤類型並不影響降解微生物的組成

小鼠腹腔微生物群落功能組成隨時間發生變化，亞硝酸還原酶——亞硝酸鹽轉換為氨鹽、賴氨酸脫羧酶——形成屍胺；1，5-戊二胺、鳥氨酸脫羧酶——腐胺升高

群落演變與多種因素相關，為法醫調查提供更多新的研究思路

研究亮點

樣本珍稀（人類遺體）

實驗設計連續（跨越冬春兩個季節，不同時間採樣）

採樣量大（不同採樣部位，實驗室和野外同步進行）

研究視角獨特（屍體分解）

分析角度多，結果豐富

熱心腸日報導讀

Science：我們死後，被哪些細菌分解？

原標題：哺乳動物分解過程中微生物群的聚集及其代謝功能

① 分析在不同土壤基質上，小鼠及人類屍體分解過程中的微生物聚集；② 一群參與氮循環的細菌及真菌群體，一個可再生的分解者網路在可預知的不同時間點會出現；③ 分解者主要來源於非根際土壤；關鍵分解者在土壤中無處不在但丰度較低；④ 土壤類型不是參與分解的微生物群體發展的主要影響因素；⑤ 不同土壤中貌似專門存儲有相似的用於分解屍體的「微生物庫」，使得最終分解屍體的微生物種類趨同。

Title：Microbial community assembly and metabolic function during mammalian corpse decomposition

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