抗體藥物質量研究應用文集︱質譜完整分子量快速檢測在抗體類藥物開發中的應用
生物製藥產業是國家戰略重點支持產業，而治療性單克隆抗體和融合蛋白是近年來生物藥物中發展最為迅速、最值得關注的部分。與傳統小分子藥物相比，抗體蛋白藥物複雜得多，質量屬性多，相應的質量檢測內容也很多。另一方面，藥物質量控制不僅僅是全面的產品放行檢測，而是需要對藥物研發和生產全過程進行嚴格的質量監控。ICH Q8、Q9和Q10分別從「質量源於設計」、「風險管理」和「質量體系」等角度對全面的質量控制策略進行了規範和闡釋，其中一個重要的理念就是需要對藥物質量屬性和工藝參數設計進行充分的研究和分析，通過風險評估確認抗體藥物研發和生產每個階段的關鍵質量屬性和工藝控制策略。
抗體研發各階段關鍵質量屬性的確認離不開對抗體質量的深度表徵研究，需要對各個工藝環節對各質量屬性的影響做透徹的分析，同時，相應的檢測技術和方法需要快速、準確和穩定，來及時對產品進行確認或對工藝參數進行優化調整。液相色譜-質譜聯用技術綜合了化合物分離分析和結構鑒定能力，在抗體藥物質量研究領域得到了廣泛應用。本文通過質譜完整分子量檢測，對單抗、雙抗和ADC（Antibody Drug Conjugates）等藥物的分子量、糖型、純度等進行分析，每個樣品檢測可在30分鐘內完成，滿足了抗體研發質量控制的需求。
一.穩定細胞株構建過程中抗體分子量和糖型的確認
穩定細胞株構建通常包括載體構建、轉染、庫細胞篩選和有限稀釋克隆等流程。在傳統的細胞株構建過程中，主要是通過細胞生長情況以及表達量對細胞株進行篩選，而沒有儘早對細胞表達抗體的質量進行監控。這可能導致篩選出來的穩定細胞株不能生產出質量和理論設計或原研葯高度一致的藥物，浪費了大量的時間、人力和財力。
對於分子量150K Da的抗體，高分辨質譜測定分子量通常可以精確到5 Da以內。在細胞株構建早期階段就通過質譜對表達抗體進行檢測，可以確認抗體氨基酸是否發生突變、信號肽是否完全切除、主要糖型與理論值或原研葯是否一致等，對可能發生的錯誤修飾進行及時修改和調整。圖1實例為某庫細胞篩選階段培養上清經Protein A純化後樣品以及相應的原研葯的質譜分析結果。可以看到，該庫細胞表達抗體與原研葯完整分子量不一致。進一步去糖後測定分子量，結果如圖2所示，表達抗體與原研葯均為145624 Da，可以推測分子量的差異來源於糖型，需通過培養工藝對糖型進行調整或者篩選其他庫細胞進行質量確認後再開展下一步工作。
圖1 庫細胞表達抗體與原研葯完整分子量檢測結果
圖2 庫細胞表達抗體與原研葯去糖分子量檢測結果
另一個單抗生物類似葯細胞株構建項目案例中，轉染細胞後即取上清純化並進行質量確認。圖3結果表明類似葯的完整單抗、輕鏈和重鏈分子量與原研葯都不一致，進一步測序確認了類似葯輕鏈比原研葯多一個精氨酸，重鏈中一個賴氨酸在原研葯相應位置為精氨酸。可見，早期階段的質量中間控制可以儘早發現問題並予以修正，可以大大提高藥物研發的效率和成功率。
圖3 單抗生物類似葯與原研葯分子量分析結果
此外，通過分子量檢測可以得到抗體糖型以及各糖型的相對比例，作為細胞篩選的質量依據。圖4為單抗庫細胞和有限稀釋克隆表達量和抗體分子量分析結果。儘管Minipool-B表達量高於Minipool-A，但A的各糖型比例與原研葯一致性更好，所以選取了Minipool-A進行下一步有限稀釋克隆篩選。同樣，在克隆篩選階段，綜合考慮表達量和糖型後選擇Clone2作為首選克隆。
圖4為單抗庫細胞和有限稀釋克隆分子量分析結果
二. 雙特異性抗體純度的快速監測
除了上面提到的表達量和糖型，純度和雜質也是抗體藥物的重要質量屬性。尤其是對於雙特異性抗體，目標雙抗的純度和其他雜質比例不僅僅關係到產量和成本，還與藥物的安全性和有效性密切相關。基於液相色譜（HPLC）和電泳的方法，如SEC、CE-SDS、SDS-PAGE等已被廣泛應用於抗體純度和雜質（聚集體、片段等）分析。此外，質譜也可以用於純度的快速監測。與色譜方法相比，質譜法樣品前處理步驟簡單，而且整個檢測和數據分析可在半小時內完成。圖5是雙抗標準品和19個樣品的質譜分析結果。樣品上清經Protein A純化後直接進樣質譜進行分析。150KD為雙抗主成分，175KD為單鏈錯配形成的雜質，通過峰高計算雜質比例。樣品6和11的175KD雜質比例較高，相應細胞株將被排除，有效縮小了細胞篩選的範圍，加快了篩選出高表達、高質量的細胞株的進度。
圖5 雙抗標準品和19個樣品的質譜分析結果
三. 抗體-藥物偶聯體（ADC）分析
ADC藥物結合了抗體的靶向性和小分子藥物的高效性，是抗腫瘤藥物的重要研究方向。抗體與小分子有多種偶聯方式，根據抗體偶聯位點可以分為賴氨酸偶聯、半胱氨酸偶聯和定點偶聯等。在ADC藥物研發過程中，需要對抗體上偶聯小分子藥物的數目（Drug Antibody Ratio value，DAR值）、偶聯位點等屬性進行深度表徵研究。其中，DAR值的傳統測定方法有紫外分光光度法、疏水作用色譜（HIC）法等。與傳統方法相比，質譜法測定DAR更為簡單快速，而且可以得到結合了不同數目藥物的偶聯體的具體信息。圖6為賴氨酸偶聯ADC藥物的典型質譜分析結果，結合了0~8個藥物的偶聯體均被檢出，計算得到ADC藥物的DAR值為3.5。此外，可以檢出其他雜質信息，同時對ADC的純度進行監控。
圖6 ADC藥物DAR值測定和偶聯分析
小結
在抗體藥物研發過程中，從細胞株構建、細胞工藝開發、純化和製劑等環節都需要進行嚴格的中間質量控制，包括Titer表達量分析、電荷異質體分析、聚體分析、肽圖、糖基化分析、殘留宿主細胞DNA、殘留宿主細胞蛋白、殘留蛋白A等檢測。中間質量監控所採用的質量分析方法與產品放行檢測相比，除了準確度和穩定性的要求，檢測速度需要更快。質譜技術具有強大的定性和定量分析能力，上文中的案例使用質譜技術對不同蛋白藥物一系列質量屬性進行分析，闡述了其在蛋白藥物臨床前研究中廣泛的應用前景。建立基於質譜技術的一系列適用於的抗體質量快速監控的整體分析解決方案，將幫助生物葯企實現高效的臨床前開發和臨床研究進程，提高抗體藥物研發成功率。
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