從複雜的微生物群或環境中識別和比較細菌

Identify and compare bacteria from complex microbiomes or environments

NGS提供一種無培養方法來鑒定可能無法通過其他方法找到的菌株.

Introduction to 16S rRNA Sequencing

16S核糖體RNA（rRNA）測序是用於鑒定和比較給定樣品中存在的細菌的常用擴增子測序方法。 16S rRNA基因測序是研究難以或不可能研究的複雜微生物群或環境樣品的系統發育和分類的完善方法。

Benefits of NGS-Based 16S rRNA Sequencing(基於NGS的16S rRNA測序的優勢)

與毛細管測序或基於PCR的方法不同，新一代測序（NGS）是一種無需培養的方法，可以分析樣品中的整個微生物群落。 憑藉在測序運行中結合多個樣本的能力，微生物學研究人員可以使用基於NGS的16S rRNA測序作為一種經濟有效的技術來鑒定可能無法通過其他方法找到的菌株。

Demonstrated Workflow for 16S rRNA Sequencing(演示了16S rRNA測序的工作流程)

Illumina提供支持16S rRNA測序的產品，從樣品和文庫製備到數據分析和解釋。 我們演示的工作流程可以幫助您將猜測工作排除在實驗之外。

16S核糖體RNA（或16S rRNA）是與Shine-Dalgarno序列結合的原核核糖體的30S小亞基的組分。 編碼它的基因被稱為16S rRNA基因，並用於重建系統發育，因為該基因區域的進化速度較慢。 Carl Woese和George E. Fox是率先在系統發育中使用16S rRNA的兩個人。

單個細菌內可以存在16S rRNA基因的多個序列。

核糖體核糖核酸（rRNA）是核糖體的RNA組分，對於所有生物體中的蛋白質合成都是必不可少的。 它構成了核糖體內的主要物質，約佔60％的rRNA和40％的蛋白質，或核糖體質量的3/5。 核糖體含有兩種主要的rRNA和50種或更多種蛋白質。 核糖體RNA形成兩個亞基，即大亞基（LSU）和小亞基（SSU）。 LSU rRNA充當核酶，催化肽鍵形成。 rRNA序列被廣泛用於研究生物體之間的進化關係，因為它們具有古老的起源，可以在所有已知的生命形式中找到。

它有幾個功能：

像大（23S）核糖體RNA一樣，它具有結構作用，充當定義核糖體蛋白質位置的支架。3"末端含有抗Shine-Dalgarno序列，其在mRNA上游與AUG起始密碼子結合。 16S RNA的3"末端與已知參與蛋白質合成開始的S1和S21蛋白結合; A.P.Czernilofsky等人的RNA-蛋白質交聯與23S相互作用，協助兩個核糖體亞基（50S + 30S）。通過腺嘌呤的N1原子（參見嘌呤化學結構的圖像）殘基1492和1493與mRNA骨架的2"OH基團之間的氫鍵形成穩定A位點中正確的密碼子 - 反密碼子配對。

16S rRNA基因用於系統發育研究，因為它在不同種類的細菌和古細菌之間高度保守。 Carl Woese開創了16S rRNA的這一用途。有人建議16S rRNA基因可以用作可靠的分子時鐘，因為來自遠緣相關細菌譜系的16S rRNA序列顯示具有相似的功能。 一些（超）嗜熱古細菌（即有序Thermoproteales）含有位於高度保守區域的16S rRNA基因內含子，並可影響「通用」引物的退火[8]。 線粒體和葉綠體rRNA也被擴增。

最常見的引物對由Weisburg等人設計，目前被稱為27F和1492R; 然而，對於一些應用，例如對於用鈦化學進行454測序（500-ish讀數是理想的）引物對27F-534R涵蓋V1至V3，可能需要更短的擴增子。 通常使用8F而不是27F。 兩條引物幾乎相同，但與8F相比，27F具有M而不是C.AGAGTTTGATCMTGGCTCAG。

PCR和NGS應用

除了高度保守的引物結合位點之外，16S rRNA基因序列含有高變區，其可以提供用於鑒定細菌的物種特異性標記序列。 因此，16S rRNA基因測序在醫學微生物學中已經成為普遍的細菌鑒定表型方法的快速且廉價的替代方法。 雖然它最初用於鑒定細菌，但隨後發現16S測序能夠將細菌重新分類為全新的物種，甚至是屬。 它也被用來描述從未成功培養的新物種。 隨著第三代測序技術進入許多實驗室，數以千計的16S rRNA序列可以在數小時內同時鑒定，從而可以進行宏基因組學研究，例如腸道菌群。

高變區

細菌16S基因含有長約30-100個鹼基對的九個高變區（V1-V9），其參與小核糖體亞基的二級結構。高變區之間的保守程度差異很大，更高的保守區域與更高級別的分類學相關，更低的保守區域更低，例如屬和種。儘管整個16S序列允許比較所有高變區，但長約1500個鹼基對，對於尋求鑒定或表徵不同細菌群落的研究而言，這可能是極其昂貴的。這些研究通常利用Illumina平台，其分別產生比454焦磷酸測序和Sanger測序便宜50倍和12,000倍的讀數。雖然便宜且允許更深的社區覆蓋，但Illumina測序僅產生75-150個鹼基對很長，而且還沒有建立可靠地在社區樣本中組裝完整基因的方案。完整的高變區可以從一個Illumina運行組裝而成，但是，使它們成為該平台的理想目標。

雖然16S高變區可以在細菌之間顯著變化，但是16S基因整體保持比其真核對應物更長的同源性，這可以使比對更容易。另外，16S基因在高變區之間含有高度保守的序列，使通用引物的設計能夠可靠地在不同分類群中產生16S序列的相同部分。雖然沒有高變區可以準確地將所有細菌從結構域分類到種類，但有些可以可靠地預測特定的分類水平。由於這個原因，許多社區研究選擇了像V4這樣的半保守的高變區，因為它可以在門系水平上提供與完整16S基因一樣精確的解析度。儘管較低保守區域在高階分類未知時很難對新物種進行分類，但它們通常用於檢測特定病原體的存在。在Chakravorty等人的一項研究中。在2007年，他們對各種病原體的V1-V8區域進行了特徵分析，以確定哪些高變區對於疾病特異性和廣泛的分析是最有用的。在其他研究結果中，他們指出V3區域在鑒定所有檢測病原體的屬性方面效果最佳，並且V6在鑒別所有CDC受檢病原體包括炭疽病菌方面最為準確。

雖然16S高變區分析是細菌分類學研究的有力工具，但它努力區分密切相關的物種。在腸桿菌科，梭狀芽孢桿菌科和消化鏈球菌科中，物種在完整的16S基因中可以具有高達99％的序列相似性。結果，V4序列可以僅相差幾個核苷酸，使參考資料庫無法可靠地將這些細菌分類為較低的分類水平。通過限制16S分析選擇高變區，這些研究可能無法觀察到密切相關的分類單元的差異，並將它們歸為單個分類單元，因此低估了樣品的總體多樣性。此外，細菌基因組可以容納多個16S基因，V1 ，V2和V6區域含有最大的種內多樣性[6]。儘管不是分類細菌種類最精確的方法，但高變區分析仍然是細菌群落研究中最有用的工具之一。

16S rRNA基因被用作分類和鑒定微生物的標準，因為它存在於大多數微生物中並顯示出適當的改變。 對於大多數細菌和古細菌的16S rRNA基因序列的類型菌株可在公共資料庫如NCBI上獲得。 但是，在這些資料庫中發現的序列質量通常不會得到驗證。 因此，僅收集16S rRNA序列的二級資料庫被廣泛使用。 下面列出了最常用的資料庫：

EzTaxon-E

http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/

EzTaxon-e資料庫是原始EzTaxon資料庫的擴展。 它包含具有有效名稱的分類群的全面16S rRNA基因序列以及未培養分類群的序列。 EzTaxon-e包含細菌和古細菌結構域的完整分層結構（從門級到物種級）。

核糖體資料庫項目

http://rdp.cme.msu.edu/

核糖體資料庫項目（RDP）是一個策劃資料庫，提供核糖體數據以及相關的程序和服務。 這些產品包括核糖體RNA（rRNA）序列的系統發育序列比對，衍生的系統發育樹，rRNA二級結構圖以及用於處理，分析和展示比對和樹木的各種軟體包。 數據可以通過ftp和電子郵件獲得。 某些分析服務也由電子郵件伺服器提供。

SILVA

SILVA為生命的所有三個領域提供全面的質量檢查和定期更新的對齊小（16S / 18S，SSU）和大亞基（23S / 28S，LSU）核糖體RNA（rRNA）序列的數據集，以及一套搜索， 引物設計和比對工具（細菌，古細菌和真核生物）。

GreenGenes

Greengenes是一個質量可控，全面的16S參考資料庫和基於de novo系統發育的分類學，提供標準的操作分類單位集。 該網站的官方主頁是http://greengenes.secondgenome.com，並獲得Creative Commons BY-SA 3.0許可。

圖片來自：https://en.wikipedia.org/wiki/16S_ribosomal_RNA

表格來自：https://en.wikipedia.org/wiki/16S_ribosomal_RNA

生信巢

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