免疫共沉澱實驗知多少

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想知道你的目的蛋白質是否與另一種蛋白質交織在一起? 可以使用免疫共沉澱 (Co-IP)來實現，然後可以通過表面等離子體共振(SPR)來發現它們是如何相互 作用的。

Co-IP主要用於檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用，是IP實驗的一種擴展， 基於IP反應的潛力，在樣品溶液中捕獲和純化主要目標（抗原等）及通過天然相互作用與靶標結合的其他的大分子。如將蛋白質A和抗體加入到含有蛋白質B的細胞解液中去，利用抗體提純，若蛋白質A，B之間有相互作用，則最後提純產物是抗體—蛋白質A—蛋白質B複合物。此外，還可以利用Co-IPs來確定在不同條件下的蛋白質相互作用。

Co-IP與傳統的IP協議非常相似，其不同之處在於，需要更溫和的分析條件。一般步驟如下:

裂解細胞

目的是打開細胞，使蛋白質可以與抗體結合，裂解的方法非常重要。非去垢劑、低鹽裂解緩衝液是裂解可溶性蛋白的一種常見方法，這種裂解最少地干擾任何蛋白質的相互作用。對於一些難溶的蛋白複合物，裂解緩衝液可能需要包含非離子去垢劑，如NP-40或Triton X-100。測試一些裂解條件，以找到最佳的裂解液，有時可根據經驗來確定。

添加抗體

添加針對目的蛋白的特異性抗體。許多抗體製造商會在產品選擇指南中提供有用的信息。最理想的是選擇一種能識別興趣蛋白質某個表位的抗體，且這個表位不會被任何其他蛋白質相互作用所掩蓋。

加Protein A/G珠子

Protein A/G 珠用來從混合物中提取和純化抗體/蛋白質複合物。Protein A和Protein G是識別和結合抗體的特殊細菌蛋白，抗體的特異性將決定應該使用哪種類型的珠子，可以諮詢抗體製造商。

傳統上，免疫沉澱珠是直徑為50-150uM的瓊脂糖球，通過離心分離純化抗體/蛋白複合物。現代技術使用直徑1-4微米的磁珠代替瓊脂珠，磁珠通過磁力作用將抗體/蛋白複合物分離。

磁珠對分子量較大的蛋白質複合物和處理少量樣品有更好的效果，避免在離心過程中出現過多的樣品損失。瓊脂糖珠通常具有較高的產量，因為它們表面積較大，可以結合更多的蛋白。

孵育

孵育期間，珠子/抗體/蛋白髮生相互作用，孵育時間由一小時到過夜不等，取決於選擇的珠子。通常，孵育時溫和地攪動，如在低速的搖臂板上，可以增加互作的機會。

收集

孵育後，需要收集抗體/蛋白複合物，通過磁性或離心法將複合物與其他細胞蛋白質分離。

洗珠子

清洗抗體/珠子複合體幾次，以去除與抗體非特異性結合的細胞物質，也有助於減少粘性細胞成分與珠子的非特異性結合。一般情況下，用冷的裂解緩衝液或PBS洗滌。此步需要優化，以找到合適的水平，不破壞蛋白質的相互作用。保存此步中使用過的清洗buffer，如果目的蛋白和伴侶蛋白從裂解液中耗盡，清洗緩衝液可以說明。

洗脫蛋白

如果使用SDS-PAGE，可以直接添加上樣緩衝液到珠子中來獲取蛋白質。如果想要分離的蛋白質用於酶實驗等，則用其他方法洗脫。一種常用的非變性洗脫液是0.1M甘氨酸，pH值較低(約2.5-3)。然而，在這些條件下，一些蛋白質仍然會發生變性或疏鬆的酶活性。

檢測蛋白

可以進行SDS-PAGE，質譜，酶實驗，等等。

用來純化蛋白質的抗體也在洗脫液中，這可能是個問題。western blot可以檢測洗脫液中的抗體，如果它們分子量接近，就掩蓋了對目的蛋白質的檢測。克服此問題，也許可以通過使用與抗體共價結合的珠子，或者WB使用的二抗和IP二抗識別不同的種屬。

使用表面等離子體共振(SPR)研究相互作用。

發現目的蛋白相互作用的值得興奮的，但是許多科學家被粘蛋白引入歧途。應該做額外的研究來確認任何潛在的相互作用，確保它們是特異性的。例如，可以使用突變分析來映射結合位點，或者，可以考慮使用SPR應用。

SPR應用不僅證實了相互作用，還提供了對親和力、熱力學的定量測量，實時動力學。SPR生物感測器，允許測量在不同溫度下的相互作用，便於對感興趣的相互作用進行熱力學分析。SPR的一個主要優點是，不需要標記你的興趣蛋白，沒有更多的標記克隆或放射性，節省時間和克隆時的潛在麻煩。如果想要檢測和闡明免疫受體和它們的配體之間的相互作用，可以考慮嘗試一種生物感測器檢測，允許測量配體對其特定抗原受體的結合率和解離率。由於SPR的優勢和巨大的性能，SPR及其相關應用已經成為動力學和親和力測定的黃金標準，SPR原則強調了大多數基於顏色的生物感測器晶元的應用。

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