科研人員建立過濾富集單倍體胚胎幹細胞的方法

近日，中國科學院上海生命科學研究院分子細胞科學卓越創新中心/生物化學與細胞生物學研究所李勁松研究組的研究成果，以Haploid embryonic stem cells can be enriched and maintained by simple filtration為題，在線發表在Journal of Biological Chemistry上。該研究建立了一種簡單、可靠且有效的單倍體細胞富集方法。

多年來，科學家對單倍體細胞的探索孜孜不倦。2011年，小鼠孤雌單倍體胚胎幹細胞（parthenogenetic haploid embryonic stem cells, PG-haESCs）建立。2012年，小鼠孤雄單倍體胚胎幹細胞（androgenetic haploid embryonic stem cells, AG-haESCs）建立。隨後，大鼠、猴子和人的 haESCs 相繼建立。單倍體細胞因其只含有一套染色體，不會遮蓋隱性性狀，在研究基因功能上可提供很大幫助；具有幹細胞的特性，能體外無限增殖且具有乾性；小鼠的孤雄單倍體胚胎幹細胞具有類精子的特性，主要表現在能使小鼠的卵母細胞受精並生出半克隆小鼠。將這些特性聯合到一起，就小鼠的 haESCs 而言，不僅為在細胞水平同時也在個體水平研究基因功能搭起了橋樑。

然而，haESCs 自出生伴隨著不斷自發二倍化的問題。自發二倍化使得從 ESCs 建立之初，科學家嘗試建立 haESCs 但未成功，直到流式分選技術（fluorescence activated cell sorter, FACS）被應用到單倍體的富集上。其原理是，Hoechst 染色後，不同 DNA 含量的細胞在激光照射下會被區分開，通過給單倍體細胞加電使其發生偏轉後收集下來，從而實現單倍體細胞富集。但Hoechst染料一定程度上影響 DNA 複製。FACS 富集回來的細胞第一代生長狀態遠不如正常傳代的細胞。暫不論流式分選所需的設備及費用，整個過程中的激光照射，加電加壓等可能給細胞帶來額外潛在的基因突變。另外，該方法需要複雜、昂貴的儀器支持，富集成本高。

在此背景下，李勁松研究組根據單倍體細胞與二倍化了的細胞的平均直徑的差異，通過過濾的方法在體外穩定地維持單倍體細胞單倍體性超過30代。該過濾系統由商業化的一片布滿5 μm 或8 μm 小孔的濾膜與一個濾膜的支撐裝置，外加一個注射器組成。成本低且均可實現無菌操作。對細胞活性及單克隆形成能力的研究發現過濾第一代細胞遠優於 FACS 富集的細胞。同時，過濾不同次數的 AG-haESCs 仍能正常支持半克隆小鼠的出生。CRISPR/Cas9 介導的基因敲除與敲入均可在過濾富集的細胞上正常實現，相應基因敲除的半克隆小鼠正常出生。此外，該方法可用於小鼠單倍體細胞的建立以及人的單倍體細胞的富集。過濾富集單倍體細胞的方法為單倍體細胞相關技術的發展、應用和推廣提供了保障。

瞿超和晏萌為論文的共同第一作者，研究工作得到了全基因組標籤計劃（Genome Tagging Project, GTP）、科技部、國家自然科學基金委員會、中科院戰略性先導科技專項（B）和上海市科委經費的支持；並獲得生化與細胞所公共技術服務中心動物實驗技術平台、細胞生物學技術平台的支持。

來源：中國科學院上海生命科學研究院

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