從PCR到NGS：基因檢測平台發展簡史
從PCR到NGS:基因檢測平台發展簡史
基因檢測，顧名思義就是通過測序等手段對基因位點進行檢測。最初的基因檢測只是檢測基因載體——染色體的數目異常，之後測序技術使得可以更清晰地認識基因序列，但在高通量測序之前，找到致病基因首先要通過各種方法進行染色體定位和確定候選基因，然後通過在該病的患者中篩查來驗證致病基因的假說。
自從1985 年Kary Mullis發明聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction, PCR)以來, PCR技術很快成為科研、臨床診斷的熱點技術。小編特意將PCR的發展歷程匯總成以下圖片，方便大家學習了解。
圖1：PCR技術發展史
傳統PCR技術在應用中一是不能準確定量, 二是容易交叉污染, 產生假陽性。今天要著重說一說實時熒光定量PCR技術和液滴數字PCR（droplet digital PCＲ，ddPCR）。
實時熒光定量PCR技術發明至今，人們利用實時熒光定量PCR技術本身的優越性把其廣泛運用於醫學診斷、海關檢驗檢疫、國防軍事、新型農業、基礎研究等領域。目前尤其在動物醫學病理和分子生物學研究領域應用十分廣泛。
簡單地說，實時熒光定量PCR技術的基本原理就是樣本核酸擴增呈指數增長，在反應體系和條件完全一致的情況下，樣本DNA 含量與擴增產物的對數成正比，由於反應體系中的熒光染料或熒游標記物（熒光探針）與擴增產物結合發光，其熒光量與擴增產物量成正比，因此通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量。
圖2：Applied Biosystems:PCR-7500
目前，實時熒光定量PCR技術所使用的熒光化學方法主要有四種，分別是DNA 結合染料法、水解探針法、雜交探針法、熒光引物法。它們又可分為擴增序列非特異和擴增序列特異兩類檢測。
影響實時熒光定量PCR試驗結果的因素:從DNA出發進行定量相對比較簡單，一般在保證引物及探針的特異性、PCR 反應體系的合理性以及DNA 模板的純度和完整性的情況下，可以保證試驗的順利進行。從RNA 出發對mRNA 進行定量時，操作比較複雜，影響試驗結果的因素也比較多。主要包括以下幾個方面：RNA 的完整性、RNA 樣品中的基因組DNA 污染、PCR 反應體系的優化、反轉錄以及內標基因的選擇。
液滴數字PCR ( droplet digital PCR，ddPCR)是新一代的最近商業化的數字PCR，可以用來檢測稀有突變、量化特定的核酸種類、分析特定基因拷貝數變化，檢測基因組擴增和基因突變可以指導靶向個體化治療[2]。
圖3：Bio-Rad ddPCR
原理及優勢ddPCR是在傳統的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應體系分成成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。經PCR 擴增後，逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度，與qPCR 相比，ddPCR 具有許多優點，比如靈敏性高，無需標準曲線以及不受不同樣品和試驗過程中PCR 擴增效率變化的影響，就能獲得絕對定量。ddPCR可以檢測到0．001%的突變，這較qPCR 靈敏性增加了1000倍。qPCR 耗費勞力和試劑，依賴於熒光信號，完全依賴標準曲線，並使用循環閾值(cycle threshold，Ct) 作為衡量標準。然而許多因素會影響Ct 值，從而影響了qPCR 的定量。更重要的是，qPCR 最高分辨在1.5 倍左右，因而不適合用於低丰度的拷貝數的檢測［3,4］。而目標miRNA，由於標準曲線難以製備，很難對其定量［4］。
NGS技術NGS技術又稱大規模平行測序或深度測序[5]，包括第二代、第三代和第四代測序技術。目前，具代表性的第二代測序平台有瑞士Roche 公司的454，美國Illumina 公司的基因組測序儀（genome analyzer，GA）、HiSeq 2000 和MiSeq， 美國ABI 公司的寡聚物連接檢測測序（sequencing by oligo ligation detection， SOLiD）5500XL，美國Life TYechnologies 公司的Ion Torrent個人化操作基因組測序儀（personal genome machine，PGM）；第三代測序平台有美國HelicosBiosciences 公司的HeliScope 遺傳分析系統和PacificBiosciences 公司的單分子實時（single moleculereal time，SMRT） 測序技術；第四代測序技術有英國Oxford Nanopore Technologies 公司的納米孔測序技術。
NGS發展史自2000年初開始，測序技術得到了快速的發展。其發展如圖所示，其中半導體測序平台和第3代單分子實時DNA測序平台以往的基於光學信號的檢測技術不同，半導體測序平台通過半導體晶元直接感應在序列合，成過程中磷酸二酯鍵3"OH基團釋放的質子；第3代測序儀通過納米孔技術記錄單個聚合酶在不受干擾情況下連續合成，其中PacBio RS II每次運行能夠產生60 000×16條序列，每條序列的平均長度達8500 bp[6]
圖4：NGS發展史
根據檢測目的不同，NGS技術在臨床中的應用主要分為以下2種策略：（1）針對已知病因的疾病設計合適的晶元，直接對多個已知的致病基因進行靶向基因組測序；（2）針對未知病因的疾病對外顯子組或全基因組進行測序。
在臨床應用中靶向基因組測序和外顯子組合全基因組測序各自持有其優缺點。靶向基因組測序的優點在於具有較高的測序深度、較低的檢測成本，同時減輕了臨床醫生對高通量數據分析的壓力，具有較好的應用前景，特別適合於複雜性疾病的臨床分子診斷。缺點是當臨床患者實際需要檢測的基因數
說到NGS,就不得不提起Illumina，Illumina在NGS平台中的應用是最為普遍的，測序成本也顯著降低，首次達到1000 美元完成人類基因組測序的目標。美國Solexa 公司於2006 年推出GA，2007 年被Illumina 公司收購，此後Illumina 公司又開發了GAⅡX、HiSeq 2500、HiSeq 3000、HiSeq 4000、HiSeq X Ten、HiSeq X Five、NextSeq 500、MiSeq系列和MiniSeq 系統[7]。
圖5：Illumina HiSeq系列
Illumina 在NGS 平台中通量最高，如Kampmann 等[8]採用GAⅡX在一個通道中一個測序循環內完成了9 個甲型流感病毒標本的全基因組測序工作。新推出的NextSeq 500 兼具了樣品製備和測序功能，其按鈕式的操作可以在許多常見測序應用之間切換。該系統能夠在一天內測序整個人類基因組和多達16 個外顯子組，NextSeq500 運行75 個測序循環只需12 h。
圖6：Illumina NextSeq 500
此外，Illumina測序成本最低，因此應用最廣泛，幾乎涵蓋了測序應用的各個方面，比如基因組學的全基因組從頭測序、重測序、外顯子和目標區域捕獲測序；轉錄組學的轉錄組測序、數字基因表達譜測序、微小RNA測序和降解組測序；表觀組學的甲基化測序、簡化甲基化測序和甲基化DNA免疫共沉澱測序等[9]。然而，Illumina 平台由於讀長較短，會導致後期用於數據刪節和分析的費用增高。
展望基因檢測並非突如其來，在人類基因組計劃及其大量相關研究的支持下，基因信息對人類健康逐漸顯示出非凡的意義，隨後基因檢測才悄然興起。依託PCR技術平台、高通量測序技術基因檢測的發展十分迅速，不久的將來以基因檢測為主要基石的精準醫療將從早期預測、個性化診療、藥物研發、免疫治療等方面使更多的人受益。
上海吉濤生物科技有限公司也依託以上平台（qPCR、ddPCR、NGS），聚焦癌症的早期篩查及腫瘤預後，小編也會在下一期的文章中為您繼續帶來更多信息，一起期待吧！
參考文獻：
[1] 閆雯，尤崇革.新型PCR技術[J]蘭州大學學報:醫學版，2017，43（1）:60-65
[2] Sanders R，Huggett JF，Bushell CA，et al． Evaluation of digital PCRfor absolute DNA quantification［J］．Anal Chem，2011，83 ( 17) :6474 － 6484
[3]Whale AS，Huggett JF，Cowen S，et al． Comparison of microfluidicdigital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copynumber variation［J］． Nucl Acids Res，2012，40( 11) : 82．
[4]Ma J，Li N，Guarnera M，et al． Quantification of plasma miRNAs bydigital PCR for cancer diagnosis[J].Biomark Insights，2013，8: 127－ 136．
[5]Behjati S, Tarpey P S. What is next generation sequencing[J]. Arch Dis Child Educ Pract Ed, 2013, 98(6): 236-238.
[6] CHAISSON M J，HUDDLESTON J，DENNISM Y，et al. Resolving the complexity of the human
genome using single-molecule sequencing[J].Nature，2015,517（7536）：608-611.
[7] Illimina. Systems[EB/OL]. [2016- 4- 7]. http://www.illumina.com/.
[8] Kampmann M L, Fordyce S L, Avila-Arcos M C, et al.A simple method for the parallel deep sequencing of fullinfluenza A genomes [J]. J Virol Methods, 2011,78(8):243-248.
[9] 華大基因. 華大技術平台[EB/OL]. [2016-4-7]. http://www.genomics.cn/navigation/show_navigation?nid=220.
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