中國團隊Cell重大進展：首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬誕生

近日，由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院、暨南大學等院校科研人員組成的國際研究團隊經過四年努力，首次利用基因編輯技術（CRISPR/Cas9）和體細胞核移植技術，成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬，精準地模擬出人類神經退行性疾病。相關研究成果於北京時間3月30日在線發表於《細胞》。

本文轉載自「澎湃新聞」，原標題為：中國動物疾病模型重大進展：首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬誕生 。

1872年，亨廷頓病由美國醫學家喬治?亨廷頓首次發現並因此命名。患病者會表現出手舞足蹈狀，故又被稱為「致命的舞蹈」。

實際上，類似於阿爾茨海默症（AD）、帕金森綜合征（PD）、肌萎縮性脊髓側索硬化症（ASL）等，亨廷頓病是一種神經退行性疾病。但和阿爾茨海默症等疾病不同的是，亨廷頓病還是一種常染色體顯性遺傳疾病。這就意味著，只要父母一方患有疾病，子女就有50%的概率面臨相同的命運，甚至世世代代難以逃脫「魔咒」。

目前，該疾病沒有有效治療方法，「看著他走向死亡」是患者家屬的最後心路。過去的20年時間裡，葯企進行了近百次臨床試驗，研究了治療亨廷頓症的41種不同組合藥物，但只有2種藥物獲得許可，並且只能緩解癥狀。

最新的進展是，該疾病的大動物模型成功建立。北京時間3月30日，生物學頂級學術期刊《細胞》（Cell）在線發表了中國科學家的一項重大成果：首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術和體細胞核移植技術（SCNT），成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬，精準地模擬出人類神經退行性疾病。2個月以前，中國科學家獲得全球首個體細胞克隆猴的成果也發表在該期刊。

利用基因編輯技術（CRISPR/Cas9）等培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬

論文共同通訊作者為暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院李曉江教授、中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學研究員、美國埃默里大學李世華教授。李曉江是亨廷頓病研究領域的權威，於2008年和李世華在世界上首次利用轉基因的方法建立了非人靈長類的亨廷頓疾病猴模型。賴良學則長期從事豬等大型哺乳動物的克隆，2010年和李曉江、李世華合作建立了首例轉基因亨廷頓舞蹈病的豬模型。

賴良學提到，2013年CRISPR/Cas9基因編輯技術的問世，讓這項亨廷頓病動物模型的研究工作出現曙光。研究團隊再次投入了長達4年的時間，最終獲得這份成果。

著名的細胞生物學家、原同濟大學校長、中科院院士裴鋼表示，2008年，我們在制定發育與生殖研究國家重大科學研究計劃"十二五"專項規劃時，就前瞻性地布局了大型實驗動物模型包括豬和猴的培育內容，並在後來的「幹細胞國家重大科學研究計劃」中持續加大經費投入。

裴鋼評價，我國在基因編輯猴和克隆猴的研究中相繼取得突破性成果，這次我國科學家在豬的疾病模型研究中又取得重大進展，表明我國在大動物模型的研究中已走在世界前列，將極大地推動我國生物醫藥產業的創新發展。

從事多年亨廷頓病研究的權威專家、美國加州大學洛杉磯分校楊向東教授也指出，亨廷頓舞蹈病基因敲入豬的建立是神經退行性疾病研究領域中的一個里程碑式的發現，使科學家能更深入了解神經細胞死亡的機制及尋找有效的治療方法。

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定點敲入人致病基因

亨廷頓病的病因是，患者體內的亨廷頓基因外顯子1發生了CAG三核苷酸重複突變，進而引發其編碼的亨廷頓蛋白（HTT）多聚谷氨醯胺（polyQ）序列延長所致。實際上，除亨廷頓病之外，多聚谷氨醯胺序列延長還會導致其他至少8種神經退行性疾病，包括脊髓小腦共濟失調、脊髓延髓肌肉萎縮症（肯尼迪病）等。

值得一提的是，亨廷頓病是由單基因突變導致的神經退性疾病，這使之成為一個理想的疾病模式，可用於研究蛋白質錯誤摺疊如何引起選擇性的神經退性病變，也是以後研究多基因突變病症的基礎。

研究團隊利用CRISPR/Cas9基因編輯技術將人突變的亨廷頓基因，即人外顯子1中包含150 CAG重複序列精確地插入豬的亨廷頓蛋白內源性基因中。研究團隊通過PCR篩選了2430個融水胎兒豬成纖維細胞，最終確定了9個陽性克隆細胞。

研究團隊挑選了其中一個細胞克隆株用於體細胞核移植，最終獲得2880個胚胎。這些胚胎被轉移至16頭代孕豬，其中10頭代孕豬懷孕成功，排除流產後獲得了7頭自然產下的小豬。

PCR基因型分析和DNA測序結果顯示，共有6頭豬攜帶了擴展CAG重複的人類亨廷頓蛋白外顯子1。這6頭豬即被稱為F0代。

隨後，研究團隊用F0代母豬和野生型公巴馬香豬交配，獲得F1代豬。F1代公豬和野生型母巴馬香豬交配，獲得F2代豬。論文中數據顯示，過去的兩年時間裡，研究團隊通過這種繁殖方式，獲得了15頭F1代豬和10頭F2代豬，全都呈現突變亨廷頓蛋白陽性。

賴良學告訴澎湃新聞，「論文發表之後，還在繼續產生後代，現在所有的基因敲入豬加起來，差不多有近50頭了。」

賴良學強調，「以前用轉基因技術將外源基因轉進去之後，豬本身的亨廷頓蛋白也在同時起作用，這次通過基因編輯敲入，豬本身基因是破壞掉的。這樣，豬本身的亨廷頓基因就不會表達了，純粹表達人致病基因。結果出來的癥狀、病理變化都是跟自然發生的是一致的。」

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癥狀、病理與人類似

亨廷頓病主要特點是軀體和四肢不可控制地舞蹈樣運動，漸進性認知能力下降和精神障礙，主要病理特徵則為大腦紋狀體區中型棘突神經元（MSN）逐漸丟失。

論文中數據提到，截至論文最終版本，年齡最大的F0代為30個月，最大的F1是12個月，F2代則還是新生豬。因此，研究團隊研究焦點主要放在F0代和F1代。

研究團隊首先要確定，致病基因有沒有讓這些基因敲入豬表現出和人一致的年齡相關的神經學癥狀，並且這些癥狀是否遺傳給後代。

一般來說，亨廷頓病患者發病多在35歲到50歲，表現為舞蹈樣癥狀、認知和精神障礙。患者生命持續約10到20年，甚至有2-3年即去世的病例。令人惋惜的是，亨廷頓病發病時間一般已超過生育年齡，且為顯性遺傳，因此大多數患者都在發病前已「悄然」遺傳給下一代。

賴良學提到，「除非採用基因檢測，否則很難在沒有發病前意識到自己患病。」

研究結果顯示，基因敲入豬在4個月以前沒有表現出明顯癥狀，和同性別、同年齡野生型豬相比，體重增加也很少。

年齡較大的基因敲入豬皮膚則會有嚴重的褶皺和下垂。一些F0代基因敲入豬在5個月和10個月之間會過早死亡，也通常表現出走路畸形。這些癥狀都和人類相似。

賴良學介紹，「4個月以後，運動能力就開始受到一定的影響，正常走可能看不出來，但放到跑步機上，讓它使勁跑，它跑著跑著就不行，比正常的豬運動能力差。」論文中提到，用跑步機來觀察F0代豬的運動功能，結果顯示，一頭5個月大已經表現出癥狀的基因敲入豬無法和正常對照組一樣運動，其他F0代豬也表現出類似的跑步困難。

值得一提的是，這頭5個月大的基因敲入豬在跑步機測試2天後即死亡了。研究團隊認為，這一點或許說明基因敲入豬難以承受運動負荷，呼吸衰竭可能是這頭豬死亡的直接原因。

而肺功能障礙和吸入性肺炎或窒息也可能是亨廷頓患者的主要死因。

另外，基因敲入豬表現出呼吸困難或者呼吸不規律。目前，呼吸困難只在基因敲入豬身上表現出來，此前在小鼠和其他動物模型上均未看到。

除癥狀之外，這些基因敲入豬的大腦區域選擇性神經病理學也和人類相似。病理學分析顯示，5個月大基因敲入豬大腦尺寸比同齡的野生型豬要小，大腦皮層的厚度和紋狀體的尺寸也更小。對5個月大的已有癥狀的基因敲入豬進行MRI（核磁共振成像）分析也顯示出，它們的側腦室擴大、紋狀體尺寸則減小。

另外，163個臨床案例顯示，相比殼核，紋狀體的尾狀核會提前發生退化。而5個月大的有癥狀的基因敲入豬的紋狀體也表現出一致的退化順序。

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代代相傳、多因素決定能活多久

值得一提的是，此前研究團隊用轉基因試圖建立的猴模型、豬模型，皆因表達外源性致病基因片段的毒性過強，出生不久後即死亡。而研究團隊此番成果的重要性之一就在於實現了傳代。

研究結果顯示，F1代在基因表達、體重增加、早期死亡、運動困難、呼吸困難等方面都和F0代類似。這意味著，發生在亨廷頓病患者身上的「遺傳性」在基因敲入豬模型上也同樣實現。

賴良學表示，「和人一樣，這些豬也可以發育到性成熟（豬性成熟在5-6個月），可以有後代。2010年我們發過的文章是用轉基因豬，它的癥狀就太明顯了，表達量太高，所以生下來幾天就死了。李曉江教授在美國用的轉基因猴也一樣，也沒活下去。沒活下來就沒有用，並沒有形成這個動物模型。」

不過有趣的是，基因型分析顯示，CAG重複並不穩定。實驗結果得出，在F0代中是130-150 CAGs，F1代是113-206 CAGs，F2代是118-230 CAGs。另外，在不同組織中CAG重複也是不一致的。

賴良學認為，這或許是造成個體之間發病時間不一樣、發病輕重也不一樣的原因。

論文中還提到一個注意點，一頭含有206 CAGs的基因敲入豬比其它含有113-138 CAGs的幾頭豬壽命要長，這就暗示CAG重複長度並不是生命長短的唯一決定因素。

研究團隊指出，環境壓力以及其他因素同樣能影響這些豬最終能活多久。

研究也確實發現，對F1代的基因敲除豬採用「單間」飼養，也就是幫助它們減少環境壓力後，它們的壽命比F0代這些「群體」飼養的基因敲除豬要長。

值得一提的是，該項研究之所以被視為神經退行性疾病研究領域中的一個里程碑式的發現，關鍵一點還在於此前經常使用的模型為小鼠等嚙齒類動物，而種間差異實際上是一道很大的研究鴻溝。

論文中指出，儘管亨廷頓症小鼠模型在突變亨廷頓蛋白方面表現出和年齡相關的累積，以及其他一些神經學癥狀，但基因敲入亨廷頓小鼠缺乏明顯的神經退行性，而這正是亨廷頓病經典的病理學標記。

當然，和非人靈長類動物模型相比，豬和人類要遠一些。但豬模型的明顯優勢在於，繁殖周期快（5-6個月即能性成熟）、一胎產仔量大（平均7-8頭小豬）。賴良學舉例表示，「以後也可以用類似的方法建立猴子模型，但通過猴子模型觀察和年齡相關的神經退行性癥狀，以及利用它傳代再觀察後代，這將是一個很長的周期。」

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